[发明专利]一种葡萄糖氧化酶酶活性的测量方法

说明书

技术领域

本发明属于酶活性测量技术领域，具体涉及一种葡萄糖氧化酶酶活性的测量方 法。

背景技术

葡萄糖氧化酶是一种具有高效催化效率的糖蛋白，在有氧气的情况下催化葡萄糖 转化为葡萄糖酸和过氧化氢，葡萄糖氧化酶活力的测量是研究其性能的基础，目前有一些 方法来测量，如盐酸滴定法中，当向葡萄糖氧化酶催化β-D-葡萄糖反应体系中加入氢氧化 钠时，反应会被其终止，然后再用一定量的盐酸溶液滴定，计算出盐酸溶液的消耗量，从而 得出葡萄糖氧化酶的活性。

但是大多数研究者还是更倾向于利用其催化β-D-葡萄糖时产生的过氧化氢，在过 氧化物酶存在的情况下，催化显色剂，测定有色产物的生成速率，以此测定酶的活性。苯酚 和邻联茴香胺是两种常见的发色体。但是，苯酚易挥发，对人体有害，邻联茴香胺在水溶液 中的溶解度很低，而且生成的有色产物的最大吸收峰在400nm处，该吸收峰处不稳定的，容 易被样本中的一些背景材料所干扰。

发明内容

本发明目的在于克服现有技术缺陷，提供一种葡萄糖氧化酶酶活性的测量方法。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种葡萄糖氧化酶酶活性的测量方法，其包括如下步骤：

1）配置pH值为5.8的磷酸盐缓冲液，然后室温下依次加入辣根过氧化物酶液、葡萄糖氧 化酶液、愈创木酚溶液和葡萄糖溶液；

2）当加入葡萄糖后酶促反应开始，此时开始计时，在吸收波长为470nm条件下采用紫外 可见光分光光度计进行时间扫描，获得产物四邻甲氧基连酚的吸光值随时间的变化数据；

3）根据朗伯比尔定律将四邻甲氧基连酚的吸光值换算为浓度，然后以时间为横坐标， 浓度为纵坐标，在excel中作散点图，添加趋势线，趋势线斜率即为四邻甲氧基连酚的生成 速率，该生成速率乘以系数4即得到葡萄糖氧化酶催化葡萄糖的反应速率，再根据酶活力单 位定义进行换算即得到葡萄糖氧化酶酶活性。

依据朗伯比尔定律，采用公式c=A/εb将四邻甲氧基连酚的吸光值换算为浓度；式 中，c为四邻甲氧基连酚的浓度；A为吸光值；ε为四邻甲氧基连酚470nm处的摩尔吸收系数；b 为比色皿光程，1cm。

其中，四邻甲氧基连酚的生成速率的计算原理如下所示：

；

式中，v为四邻甲氧基连酚的生成速率；

A₂、A₁分别为t₂、t₁时四邻甲氧基连酚470nm处的吸光值，t₂、t₁单位s；

b为比色皿光程，1cm；

ε为四邻甲氧基连酚470nm处的摩尔吸光系数。

具体的，酶促反应中，辣根过氧化物酶的浓度为2.5×10^-5mmol/L；葡萄糖氧化酶的 初始浓度为9×10^-6mmol/L，愈创木酚的初始浓度为3mmol/L；葡萄糖的初始浓度为50mmol/ L。

和现有技术相比，本发明的有益效果：

本发明方法利用光谱学仪器-紫外可见光分光光度计进行测量，使用的体系是葡萄糖 氧化酶（GOD）-辣根过氧化物酶（HRP）-愈创木酚（Guaiacol）耦联体系，利用愈创木酚和葡萄 糖氧化酶催化葡萄糖产生的过氧化氢在HRP催化下生成的有色产物四邻甲氧基连酚，该有 色产物在470nm波长光照射时有光吸收，而且随着有色产物的增加，光的吸收越强，吸光值 越大。根据470nm处四邻甲氧基连酚的摩尔吸光系数，利用朗伯比尔定律换算为四邻甲氧基 连酚的浓度，做出时间-浓度散点图，其斜率便是该四邻甲氧基连酚的生成速率。然后根据 反应比例乘以相应系数4得到GOD催化葡萄糖的反应速率，再根据酶活力单位定义进行换算 即可。

此外，本发明试验过程中还使用邻联茴香胺方法测量，对比吸光度的变化。总体来 说，葡萄糖氧化酶（GOD）-辣根过氧化物酶（HRP）-愈创木酚（Guaiacol）耦联体系测量葡萄糖 氧化酶酶活性的新方法具有操作简便，便于控制，反应现象明显，灵敏度高，重复性好等优 点。

附图说明

图1为四邻甲氧基连酚的时间浓度变化图；

图2为本发明葡萄糖氧化酶-辣根过氧化物酶-愈创木酚耦联体系的光谱扫瞄图；

图3为溶液pH值对葡萄糖氧化酶酶活性的影响；