[发明专利]一种DC细胞的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及细胞制备领域，具体涉及一种DC细胞的制备方法。

背景技术

DC细胞，全称树突状细胞(DendriticCells,DC),是近年来倍受人们关注的专职抗原呈递细胞，能高效地摄取、加工及呈递抗原，启动T细胞介导的免疫反应。未成熟的DC具有较强的迁移能力，成熟的DC能有效激活初始型T细胞，处于启动、调控、并维持免疫应答的中心环节。

常规的DC细胞制备，都是从新鲜的全血中分离得到PBMC细胞，然后直接进入DC细胞制备的环节，原料全血的获得具有偶然性和局限性，DC制备的时间和规模并不可控。

发明内容

本发明的目的是提供一种通过冻存复苏的PBMC细胞制备DC细胞的方法，克服了原料获得的偶然性和局限性，能够随时进行DC细胞的制备，且DC细胞活力和纯度都较高。

本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：

一种DC细胞的制备方法，其步骤包括，

(1)、取出冻存的PBMC细胞在37℃的水浴中快速摇晃，使其融化；

(2)、用GT-T551无血清培养基调整单个核淋巴细胞浓度为1×10⁶-3×10⁶个/mL，然后将调整好浓度的单核淋巴细胞以2-4mL/孔加入六孔板中，贴壁1-2小时，最后吸弃六孔板的每个孔内的上层未贴壁细胞；

(3)、在六孔板的每个孔内分别加入DC培养基2-4mL，置于二氧化碳培养箱内，二氧化碳浓度为5％，温度为37％，培养45-50小时；

(4)、在六孔板的每个孔内补充加入诱导DC细胞的混合因子0.05-0.1mL后继续培养22-26小时；

(5)、在六孔板的每个孔内补充加入诱导DC成熟的因子0.08-0.16mL后再培养22-26小时。

2.根据权利要求1所述的DC细胞的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)中的PBMC细胞冻存于-196℃的液氮中。

所述步骤(2)中，用GT-T551无血清培养基调整单个核淋巴细胞浓度为1×10⁶-3×10⁶个/mL，然后将调整好浓度的单核淋巴细胞以2-4mL/孔加入六孔板中，贴壁1.5小时，吸弃六孔板的每个孔内的上层未贴壁细胞。

所述步骤(3)中，在六孔板的每个孔内分别加入DC培养基2-4mL，置于二氧化碳培养箱内，二氧化碳浓度为5％，温度为37％，培养48小时。

所述步骤(3)中的DC培养基包含有GT-T551无血清培养基、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子、白细胞介素4和CD40L。

优选的，所述GT-T551无血清培养基、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子、白细胞介素4和CD40L的加入量配比为1mL:950-1050U：450-550U：450-550ng。

进一步优选的，所述GT-T551无血清培养基、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子、白细胞介素4和CD40L的加入量配比为1mL:1000U：500U：500ng。

所述步骤(4)中的诱导DC细胞的混合因子的组分中,1mL诱导DC细胞的混合因子中包含950-1050U粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子、450-550U白细胞介素4和950-1050U的干扰素γ。

优选的，所述步骤(4)中的诱导DC细胞的混合因子的组分中,1mL诱导DC细胞的混合因子中包含1000U粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子、500U白细胞介素4和1000U的干扰素γ。

优选的，所述步骤(4)中在六孔板的每个孔内补充加入诱导DC细胞的混合因子0.75mL后继续培养24小时。

优选的，所述步骤(5)中，在六孔板的每个孔内补充加入诱导DC成熟的因子0.12mL后再培养24小时。

所述步骤(5)中，诱导DC成熟的因子为1000U/mL肿瘤坏死因子。

本发明采用了冻存的PBMC细胞，并配合本发明所特有的DC培养基、诱导DC细胞的混合因子及诱导DC成熟的因子才能培养成高纯度及成活率非常高的DC细胞。

与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

(1)本发明采用冻存复苏的PBMC细胞直接制备DC细胞，而现有技术中采用从新鲜的全血中分离得到PBMC细胞制备DC细胞，所以本发明克服了原料全血的获得的偶然性和局限性，能够随时进行DC细胞的制备。

(2)本发明提供的DC细胞的制备方法非常便捷，DC细胞制备的时间和规模都能很好的得以控制。

(3)本发明配制的DC细胞的质量可控，DC细胞活力和纯度都非常高。