[发明专利]一种长效的重组狂犬病病毒疫苗株及其制备方法

说明书

本发明公开了一种长效的重组狂犬病病毒疫苗株，它是以SAD‑B19为母本毒株，将所述母本毒株G蛋白上194位的天冬氨酸突变为丝氨酸、333位的精氨酸突变为谷氨酸，并且在所述母本毒株的基因组G基因和L基因之间被插入鼠IL‑7基因。本发明还公开了该病毒疫苗株的制备方法。本发明公开的重组病毒具有良好的复制性，安全性，通过插入鼠IL‑7基因增强了免疫原性，能维持机体的长久体液免疫反应，并且再次共同免疫时，重组狂犬病毒的中和抗体水平能够迅速升高，是一种优良的狂犬病疫苗候选株。

技术领域

本发明属于动物疫苗技术领域，具体涉及一种长效的重组狂犬病病毒疫苗株及其制备方法。

背景技术

狂犬病是最古老的传染病之一，是由狂犬病毒(Rabies virus，RABV)引起的一种人畜共患传染病。狂犬病是迄今为止人类病死率最高的急性传染病，一旦发病，病死率几乎达100％。近些年，我国平均每年约有3000人左右死于狂犬病，位居传染病死亡人数前三位，多数是由于被动物咬伤或者抓伤而被感染。而在暴露前和暴露后及时接种疫苗可以有很好的保护作用，当前广泛应用的狂犬病疫苗主要是原代细胞培养疫苗和传代细胞纯化疫苗等灭活疫苗，这些疫苗虽然具有安全、有效等优点，但狂犬病暴露人群通常需要在较长时间(21天)内进行多次免疫注射(至少4次)。此外，此种疫苗价格昂贵，进一步阻止了其在发展中国家的使用。这样对于一些流浪动物及野生动物的免疫接种则很难实现。在我国，街头的流浪狗、猫等动物为当前主要的传染源，将流浪的动物进行有效的免疫是狂犬病防控的关键。因此，当前狂犬病毒研究的主要目标之一是发展低毒、可简化免疫程序及长期有效的狂犬病疫苗。

重组狂犬病病毒疫苗是一种利用反向遗传技术对狂犬病毒进行改造，有目的性地改变病毒的基因组结构，从而改变病毒的生物学特性，以增加安全性和免疫原性。欧美许多国家已经将重组狂犬病病毒疫苗应用于野生动物的狂犬病防控。1994年Schnell等第一次运用反向遗传技术成功的改造并拯救出狂犬病毒SAD B19株(Schnell MJ1,Mebatsion T,Conzelmann KK.Infectious rabies viruses from cloned cDNA.EMBO J 1994,13(18):4195-203.)，目前应用的重组狂犬病病毒疫苗包括SAD B19株、RC-HL株(Ito H,MinamotoN,Watanabe T,Goto H,Rong LT,Sugiyama M,Kinjo T,Mannen K,Mifune K,Konobe T,etal.(A unique mutation of glycoprotein gene of the attenuated RC-HL strain ofrabies virus,a seed virus used for production of animal vaccine inJapan.Microbiol Immunol.1994,38:479–482.)、HEP-Flury株(Inoue Ki,Shoji Y,KuraneI,Iijima T,Sakai T,Morimoto K.An improved method for recovering rabies virusfrom cloned cDNA.J Virol Methods.2003Feb；107(2):229-36.)等。随后基于以这些病毒为母本，通过反向遗传学系统基础上构建了表达各种细胞因子，如MIP-1alpha(Zhao L,Toriumi H,Wang H,Kuang Y,Guo X,et al.Expression of MIP-1alpha(CCL3)by arecombinant rabies virus enhances its immunogenicity by inducing innateimmunity and recruiting dendritic cells and B cells.J Virol.2010,84:9642–9648.)、GM-CSF(Ming Zhou,Lei Wang,Ling Zhao,Zhen F.Fu,et al.Recombinant rabiesvirus expressing dog GM-CSF is an efficacious oral rabies vaccine fordogs.Oncotarget.2015Nov 17；6(36):38504-16.)，缺失相关结构蛋白，如缺失M基因、P基因或G基因的重组病毒疫苗(McGettigan JP,David F,Schnell MJ,et al.Safety andserological response to a matrix gene-deleted rabies virus-based vaccinevector in dogs.Vaccine.2014Mar26；32(15):1716-9.Cenna J1,Hunter M,,McGettiganJP,et al.Replication-deficient rabies virus-based vaccines are safe andimmunogenic in mice and nonhuman primates.J Infect Dis.2009Oct 15；200(8):1251-60.Sato S,Ohara S,Tsutsui K,Iijima T.Effects of G-gene Deletion andReplacement on Rabies Virus Vector Gene Expression.PLoS One.2015May 29；10(5):e0128020.)、过表达相关结构蛋白(Hosokawa-Muto J,Ito N,Yamada K,etal.Characterization of recombinant rabies virus carrying double glycoproteingenes.Microbiol Immunol,2006,50(3):187-196.Tao L1,Ge J,Bu Z,et al.Generationof recombinant rabies Flury LEP virus carrying an additional G gene cre atesan improved seed virusfor inactivated vaccine production.Virol J.2011Sep25；8:454.)等重组病毒疫苗株。但这些疫苗均存在许多不足，其中很重要的一点是中和抗体滴度不能维持长期有效的水平上。例如，HEP-dG在第21天时中和抗体滴度达至顶峰后便下降(Xiaohui Liu,Youtian Yang,Xiaofeng Guo,et al.A Recombinant Rabies VirusEncoding Two Copies of the Glycoprotein Gene Confers Protection in Dogsagainst a Virulent Challenge.PLoS One.2014；9(2):e87105.)。因此，当前狂犬疫苗研究的主要目标之一是发展长期有效的狂犬病疫苗。