[发明专利]一种新疆沙冬青染色体荧光原位杂交的方法

说明书

技术领域

本发明涉及细胞遗传学与分子生物学技术领域，更具体地说，涉及一种新疆沙冬青染色体荧光原位杂交的方法。

背景技术

荧光原位杂交(fluorescenceinsituhybridization,FISH)是20世纪80年代末开始发展起来的一种重要的非放射性标记原位杂交技术，在研究植物分子细胞遗传学、基因扩增、基因作图及植物进化和亲缘关系的鉴定上已广泛应用，重复DNA序列、多基因家族作为探针与染色体原位杂交，容易产生较高的分辨率，因为这些DNA多拷贝序列在染色体上可达几十个kb或几个Mb。

核糖体rRNA基因是生物最重要的管家基因之一，其转录产物与核糖体蛋白质一起组装成核糖体。高等植物核主体rDNA(18S、5.8S、28S)和5SrDNA是由高度重复的序列组成，它们是基因编码区，选择压力大，属高度保守区，在植物基因组中有几百乃至上千拷贝，它们以串联重复排列的方式成簇分布在染色体的一个或数个部位，采用18SrDNA和5SrDNA探针对植物染色体进行荧光原位杂交(FISH)可以定位18SrDNA和5SrDNA在染色体上的位置，为植物基因组的进化和核型分析提供重要信息。

新疆沙冬青(又称小沙冬青、矮沙冬青)是沙冬青属中的较原始类型，已濒临灭绝，主要分布在我国西北地区的沙漠、荒漠区，是该区唯一的常绿阔叶灌木，由于新疆沙冬青染色体较小及制片方法问题，染色体核型分析结果不一致，先后有两个研究组报道，新疆沙冬青核型为5对中部着丝点染色体和4对次中部着丝点染色体；4对中部、4对近中部和l对近端部着丝点染色体组成，对于新疆沙冬青染色体形态小，相似程度高，需要用荧光原位杂交技术，以更精密的辨析新疆沙冬青的染色体，通过改造染色体制片技术和优化传统染色体原位杂交方法，获得分散开，形态好，荧光信号强的中期染色体玻片，更好地辨析新疆沙冬青染色体，以应用于新疆沙冬青的核型分析与进化研究.

因此，当前技术一种快速、精确的染色体荧光原位杂交技术，观察到分散好、荧光信号强的染色体分裂相。

发明内容

本发明提供一种新疆沙冬青染色体荧光原位杂交的方法。

为了解决上述问题，本发明所采用的技术方案如下：一种新疆沙冬青染色体荧光原位杂交的方法，包括以下步骤：

S1：染色体玻片标本的制备，新疆沙冬青种子在28℃温箱中常规培养，待根尖生长至2-3厘米时，切下生长旺盛的根尖在1.5毫升离心管中保持湿润，置密闭容器中用N₂O处理2.5小时，取出根尖用90%冰醋酸处理10分钟，即转入70%乙醇中固定，置-20℃长期备用，取固定后的2-3个根尖，用蒸馏水洗净，切生长点放入含1%果胶酶和2%纤维素酶的缓冲液中，37℃解离45分钟，离心先后用冷蒸馏水，无水乙醇洗涤两遍，最后放入30微升冰醋酸中，每张玻片滴5微升左右悬液展片，空气干燥后放紫外交联仪处理固定染色体，镜检分散良好的染色体玻片，置-20℃长期备用；

S2：18SrDNA、5SrDNA和端粒探针制备与探针变性，选取同属于豆科的植物大豆5SrDNA和18SrDNA序列设计引物，以新疆沙冬青为模板扩增重复序列，采用Nicktranslation法制备探针，端粒采用拟南芥端粒DNA序列为探针，Am13引物为fwd和Am13以新疆沙冬青为模板扩增重复序列。分别标记FITC绿色和TexasRed红色荧光；

S3：探针与染色体共变性，制备好的染色体玻片，经过120-125毫焦/平方厘米的紫外交联仪处理1分钟固定染色体，在染色体位置加5微升的探针，其质量不超过100纳克，盖上盖玻片，放入密闭保湿的饭盒中，在沸水中煮沸15分钟，迅速冷却变性的染色体和探针；

S4：杂交与杂交后洗脱，遮光变性的玻片和探针，取出玻片放入55℃烘箱中，经过大于4小时的保温复性杂交，取出玻片置于含2×SSC溶液的玻片染色缸中，室温漂洗5分钟，去除玻片，接着转至另一含2×SSC溶液的玻片染色缸，55℃漂洗25分钟，取出玻片，空气晾干后保湿；

S5：制片与信号检测，在制备好的玻片上滴加荧光染料5微升DAPI和5微升2×SSC溶液，盖上盖玻片，在盖玻片上覆上吸水纸，用橡皮敲打1-2分钟，使用德国DM750M徕卡金相显微镜观察，找到良好的染色体分裂相，用不同的激发光获得，蓝色，红色和绿色的杂交信号；用LeciaCW4000FISHsoftware进行图像采集与合成。