[发明专利]一种海洋菌株催化不对称还原制备手性苯丙氨酸的方法

权利要求书

1.一种海洋菌株催化不对称还原制备手性苯丙氨酸的方法，其特征在于包括以下步骤：

1)细胞液制备：将菌种接入2216L培养基中培养，得发酵液，离心获得细胞，用缓冲液重悬、洗涤，配制成细胞液；所述菌种为南海芽孢杆菌(Bacillus nanhaiensis)DSF-15A2，所述南海芽孢杆菌(Bacillus nanhaiensis)DSF-15A2已于2014年03月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏中心登记入册编号为CGMCC No.8969；

2)全细胞催化反应：在步骤1)得到的细胞液中，加入苯丙酮酸和氨基供体作为底物，再加入辅助底物用于辅酶循环再生，反应后得到含有产物L-苯丙氨酸的反应液；

3)分离与检测：将步骤2)得到的含有产物L-苯丙氨酸的反应液离心去除沉淀，上清液加入等量的甲醇，震荡混合均匀，离心去除沉淀，上清液稀释后进行测定，苯丙酮酸的浓度用高效液相色谱检测，产物L-苯丙氨酸的浓度和对映体过量值用高效液相色谱测定，所述沉淀为蛋白质。

2.如权利要求1所述一种海洋菌株催化不对称还原制备手性苯丙氨酸的方法，其特征在于在步骤1)中，所述菌种接入的量按质量百分比为2216L培养基的1％。

3.如权利要求1所述一种海洋菌株催化不对称还原制备手性苯丙氨酸的方法，其特征在于在步骤1)中，所述2216L培养基的组成为：1～15.0g/L蛋白胨，1～10.0g/L酵母粉，0.1～1g/L牛肉膏，0.1～2g/L柠檬酸钠，0.1～1g/L NH₄NO₃，0.1～2g/L乙酸钠，用海水配制至1L。

4.如权利要求1所述一种海洋菌株催化不对称还原制备手性苯丙氨酸的方法，其特征在于在步骤1)中，所述培养的条件为：起始pH6.5～8.0，装液量体积分数为5％～15％，培养温度20～40℃，摇床转速150～250rpm，培养时间12～48h。

5.如权利要求1所述一种海洋菌株催化不对称还原制备手性苯丙氨酸的方法，其特征在于在步骤1)中，所述离心的条件为：在冷冻离心机中，4℃，8000rpm，离心15min。

6.如权利要求1所述一种海洋菌株催化不对称还原制备手性苯丙氨酸的方法，其特征在于在步骤1)中，所述缓冲液采用浓度0.01～0.2mol/L，pH为7～13的Tris-盐酸、乙酸钠、碳酸钠、磷酸钾中至少一种。

7.如权利要求1所述一种海洋菌株催化不对称还原制备手性苯丙氨酸的方法，其特征在于在步骤1)中，所述重悬的条件为弃上清液，沉淀用Tris-盐酸缓冲液重悬，pH 6.5～8.0。

8.如权利要求1所述一种海洋菌株催化不对称还原制备手性苯丙氨酸的方法，其特征在于在步骤1)中，所述洗涤是重复操作3次；所述细胞液的质量浓度为0.025～100g/L。

9.如权利要求1所述一种海洋菌株催化不对称还原制备手性苯丙氨酸的方法，其特征在于在步骤2)中，所述氨基供体选自丙氨酸、氨水、NH₄Cl、NH₄NO₃、甲酸铵中的一种。

10.如权利要求9所述一种海洋菌株催化不对称还原制备手性苯丙氨酸的方法，其特征在于所述氨基供体选自氨水或NH₄Cl。

11.如权利要求1所述一种海洋菌株催化不对称还原制备手性苯丙氨酸的方法，其特征在于在步骤2)中，所述辅助底物选自葡萄糖、甘油、木糖、半乳糖、异丙醇中的至少一种。

12.如权利要求11所述一种海洋菌株催化不对称还原制备手性苯丙氨酸的方法，其特征在于所述辅助底物选自葡萄糖和甘油中的至少一种。