[发明专利]一种体外获能后精子质量评估的试剂盒及其使用方法

权利要求书

1.一种检测体外精子获能液中唾液酸酶的试剂盒，其特征在于：所述的试剂盒由检测缓冲液1、BWW培养液、体外获能液、荧光试剂、唾液酸酶标准原液和检测缓冲液2组成；所述的检测缓冲液1为磷酸缓冲液或者BWW培养液；所述的检测缓冲液2为含0.05 mmol/l 乙酸钠和0.25μg/μl牛血清白蛋白的磷酸缓冲液；所述的体外获能液为含HSA 5mg/ml的HTF。

2.根据权利要求1所述的一种检测体外精子获能液中唾液酸酶的试剂盒，其特征在于：所述的唾液酸酶标准原液为产气荚膜梭菌唾液酸酶，浓度为5U/ml。

3.根据权利要求1所述的一种检测体外精子获能液中唾液酸酶的试剂盒，其特征在于：所述的荧光试剂是2′-4-甲基伞形酮基-α-D-N-乙酰神经氨酸钠。

4.根据权利要求3所述的一种检测体外精子获能液中唾液酸酶的试剂盒，其特征在于：所述荧光试剂的浓度为10mM。

5.根据权利要求1所述的一种检测体外精子获能液中唾液酸酶的试剂盒，其特征在于：所述乙酸钠的pH值为5-6。

6.根据权利要求1所述的一种检测体外精子获能液中唾液酸酶的试剂盒的使用方法，其特征在于：具体步骤如下：

A、精子的洗涤

收集新鲜液化精液标本，检测缓冲液1洗涤精子，充分除去残留的精浆成分，再离心分离出精子；

B、精子的体外获能

向A步骤分离出的精子中加入BWW培养液，采用上游法，在5%的CO₂细胞培养箱中培养，收获上游精子，计数精子数量，用体外获能液在5%的CO₂细胞培养箱中孵育精子3~4 h；离心分离，收取的上清液再次离心分离，收取上清液作为待测样本；

C、精子获能液中唾液酸酶活性的测定

（1）用检测缓冲液2将唾液酸酶标准原液按5/2.5/1.25/0.625/0.312mU/ml的浓度梯度将其稀释为唾液酸酶标准溶液，向检测板内依次加入各唾液酸酶标准溶液和待测样本；

（2）用检测缓冲液2稀释荧光试剂，将其加入上述各唾液酸酶标准溶液和待测样本的孔内，再将检测板置于37℃，避光孵育1-2小时后，用酶标仪读取各孔荧光强度，根据唾液酸酶活性标准曲线计算出待测样本的唾液酸酶活性，最后得出唾液酸酶活性/精子数目的值即可。

7.根据权利要求6所述的一种检测体外精子获能液中唾液酸酶的试剂盒的使用方法，其特征在于：所述的检测板为96孔黑板。

8.根据权利要求6所述的一种检测体外精子获能液中唾液酸酶的试剂盒的使用方法，其特征在于：用检测缓冲液2稀释至荧光试剂的浓度为0.05mM。

9.根据权利要求6所述的一种检测体外精子获能液中唾液酸酶的试剂盒的使用方法，其特征在于：酶标仪在激发波长和发射波长分别为365nm和450nm的波长下读取各孔荧光强度。