[发明专利]一种改良的大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞的分离制备方法

说明书

本发明公开了一种改良的大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞的分离制备方法。包括如下主要步骤：1)以复合酶短暂消化去除大鼠胸主动脉血管的内、外膜层，保证中膜层的完整性；2)以一小时的复合酶消化释放、分散和制备胸主动脉VSMC；3)获得高产量、活力佳、可传代的收缩型大鼠胸主动脉VSMC。本发明方法所分离的胸主动脉VSMC活性高、纯度好；分离步骤简单、耗时短、成功率高，适用于初学者的操作。

技术领域

本发明涉及生物、医药学等领域，具体涉及一种改良的、收缩型大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞的高效制备方法。

背景技术

正常生理状态下的血管平滑肌细胞(VSMC)呈收缩表型，当细胞从收缩型向合成型转变后，其增殖加快、迁移变强、并向内膜层生长，使得血管管壁加厚、管腔变窄，血流阻力增高，导致高血压、动脉粥样硬化等心血管疾病的发生。VSMC如何维持其收缩型表型、病理状态下的异常表型如何发生和转变，这些机理问题的阐述不仅有助于我们了解心血管疾病发病机理，更是研发各类心血管疾病防治手段的基础。鉴于VSMC在心血管疾病研治中的特殊作用，如何高效、简便地制备活性好、纯度高的VSMC，成为目前首要任务。

目前，分离培养VSMC的方法主要有组织块贴壁法和酶消化法。前者以器械机械剥离外膜、刮除内膜、将血管剪成1mm²的小块置于培养瓶中进行贴壁培养。该方法对操作技巧要求高，剥离外膜时易有残留，刮除内膜时用力过小会有内皮细胞残留、用力过度则易刮伤中膜层。因此，初学者采用此方法进行VSMC分离时，经常有组织块漂浮、细胞培养时间过长的问题。酶消化法则是采用蛋白酶对剔除干净周围组织的血管进行直接消化来分离VSMC。先后有人采用胶原酶、胰酶单一消化或者二酶复合消化进行VSMC分离的成功报道，但是胶原酶消化时间过长6～12小时不等，而胰酶对VSMC有较强的损害，消化时间不易掌握，容易消化不均匀导致对平滑肌细胞损伤较大，不易得到活性好、数量多的平滑肌细胞。也有人联合酶消化法和组织块贴壁法，先机械剥离外膜再进行酶消化。但是仍然存在过度牵拉中膜层、过长的酶消化等损伤平滑肌细胞等问题。

为克服现有技术的不足之处，我们综合了国内外VSMC成功分离的经验，对酶消化法进行了有效的改良。采用复合酶“二步法”，先消化内外膜，避免了去除内外膜时对中膜层产生的机械拉伤；随后再消化中膜层以释放并分离VSMC。该改良方法操作简单、分离效果重复性好，获得的VSMC的数量和质量高、活力和纯度好，特别适用于VSMC分离的初学者。

发明内容

鉴于现有技术的以上不足，本发明提出一种改良的简便高效的收缩型大鼠胸主动脉VSMC的分离方法，使所获得的收缩型VSMC的纯度高、活力好，可在体外进行传代培养。

本发明目的的实现手段如下：一种收缩型大鼠胸主动脉VSMC的体外分离制备方法，通过二步复合酶消化释放大鼠胸主动脉VSMC和细胞悬液制备大鼠胸主动脉收缩型血管平滑肌细胞,包括如下步骤

1)取乙醚麻醉大鼠，迅速剪取其胸主动脉；

2)反复冲洗胸主动脉，去掉其表面粘附的凝血等组织块；

3)剔净血管的周围组织，然后放入复合酶液中、在37℃的气浴恒温振荡器里消化45分钟，随后剥离血管外膜层、刮除内膜层和剥离中膜层；

4)以含Ca²⁺、Mg²⁺的HBSS漂洗分离的中膜层，置于干净的培养皿进行快速剪碎(1-2mm³)，然后转入放有复合酶液的6孔板内、并于孵箱中37℃、5％CO₂，消化1小时；

5)终止消化，用10ml的注射器抽打组织消化液直至细胞基本从组织残片中脱离，再用细胞筛过滤获得悬液；取滤网上的组织，重复抽打和过滤，将多次过滤后的细胞悬液一起转移到15ml的离心管里，1000转/分、离心5分钟收集细胞；

6)取含20％FBS的DMEM悬浮细胞，种入6孔板进行培养。