[发明专利]载体蛋白His6-H4-NLS-Tat及制备方法

权利要求书

1.一种载体蛋白His6-H4-NLS-Tat，其氨基酸序列如下：SEQno.1。

2.根据权利要求1所述的载体蛋白His6-H4-NLS-Tat的基因的获取方法，包括以下步骤：

1）提取全小麦基因组；

2）以小麦全基因组为模板设计引物，并在上游引物上添加酶切位点，用于原核表达载体构建；

所用引物为：

上游引物1：

GCAGCGGCCTGGTGCCGCGCGGCAGCCATATGGCTAGCATGTCCGGGCGCGGCAAGGGAGG

上游引物2：

TATACCATGGGCAGCAGCCATCATCATCATCATCACAGCAGCGGCCTGGTGCC

下游引物1

TTCCTGCCATATGAACCGCCTCCACCTGGTTTCTTCTTTGGCTGGGGGCCGCCGAAGCCG

下游引物2：

ATGAAGCTTATCTTCGTCGCTGTCTCCGCTTCTTCCTGCCATATGAACCGCCTCC

以小麦全基因组为模板，以上游引物1和下游引物1，PCR扩增，再以扩增产物为模板，以上游引物2和下游引物2，PCR扩增，扩增得到编码载体蛋白His6-H4-NLS-Tat基因序列PCR产物；

3）将编码载体蛋白His6-H4-NLS-Tat基因序列PCR产物用NcoⅠ和HindⅢ双酶切，获得NcoⅠ-His6--H4-NLS-Tat-HindⅢDNA片段，将该DNA片段构建入原核表达载体pET28a⁺中NcoⅠ和HindⅢ双酶位点之间，从而获得编码载体蛋白His6-H4-NLS-Tat的原核表达载体。

3.权利要求1所述载体蛋白His6-H4-NLS-Tat的制备方法，包括以下步骤：

1）载体蛋白His6-H4-NLS-Tat的原核表达

将权利要求2中所获得的载体蛋白His6-H4-NLS-Tat的原核表达载体质粒导入到BL21（DE3）原核表达菌体系，37℃终浓度0.1mMIPTG诱导表达载体蛋白；

2）载体蛋白His6-H4-NLS-Tat原核表达产物纯化

变性条件下，Ni亲和层析一步法纯化步骤1）获得的载体蛋白His6-H4-NLS-Tat，透析后分装冻存即得。

4.权利要求1所述的载体蛋白His6-H4-NLS-Tat的活性鉴定方法，包括以下步骤：

1）根据SDS-PAGE分析的纯度；

2）凝胶阻滞实验，确定不同N/P条件下，载体蛋白His6-H4-NLS-Tat与DNA结合形成的复合物的结合能力；

3）利用载体蛋白His6-H4-NLS-Tat携带编码荧光素酶质粒Luc-pVAX1，对乳腺癌细胞系MCF-7进行转染，通过荧光分光光度仪检测，获得转染效率结果。