[发明专利]一种载体蛋白His6-H4-NLS及制备方法

说明书

技术领域

本发明提供一种载体蛋白His6-H4-NLS，可以与编码治疗性基因的表达质粒结合，作为基因治疗用载体蛋白。同时还公开了该蛋白的制备方法，并应用此蛋白对肿瘤细胞进行效应研究，属于生物工程技术领域。

背景技术

目前用于基因治疗载体主要有两大类，即病毒衍生载体和非病毒载体。

病毒载体转染效率高，但是存在整合入人体基因组的危险及机体免疫反应，广泛应用于临床还需解决这些危险问题。

非病毒载体主要包括化学聚合物衍生载体和蛋白/多肽类衍生载体。目前化学聚合物衍生载体转染效率与病毒载体相当，但是免疫原性强，机体不易降解与清除，靶向性差，限制其应用。

蛋白/多肽类载体可分成天然蛋白类与合成蛋白类。合成蛋白类载体包括多聚精氨酸、多聚组氨酸等，依靠其所带正电荷与DNA结合，携带其进入细胞。这类蛋白/多肽类载体因其具有较强的免疫原性，不适于应用于临床。另外一类源于生物体表达的天然蛋白，他们通过特定空间结构与DNA结合，携带这些DNA进入细胞后，载体蛋白随着蛋白质体内降解途径被机体降解为氨基酸后，为机体所再利用，既无细胞毒性。如果这些蛋白为生物体内高度保守的蛋白，则免疫原性低，不引起免疫反应，也不易在血浆中降解，有利于维持血浆中的浓度。再者，蛋白/多肽类载体易与功能性多肽融合而获得诸如靶向性等优点。蛋白/多肽类载体的低毒性、低免疫原性、易获得靶向性、开发及制备成本低等优点成为基因载体的研究热点。

目前天然的蛋白/多肽类载体多采用组蛋白H1、组蛋白H2A、鱼精蛋白等高度保守的DNA结合蛋白为核心构件，融合促进转染的功能结构域，制备成融合蛋白。蛋白/多肽类载体的跨膜及运输作用机制，尚不十分明确，需要制备多种不同种类的蛋白/多肽类载体，并加以研究，获得大量实验数据，进而阐明载体蛋白转运的作用机制。

发明内容：

本发明提供了一种载体蛋白His6-H4-NLS，可以与编码治疗性基因的表达质粒结合，作为基因治疗用载体蛋白。

本发明进一步提供了载体蛋白His6-H4-NLS的基因的获取方法，其特点是将pET28a⁺质粒上编码的His6的基因片段、来源于高度保守的小麦组蛋白H4基因片段与来源于猴病毒40大肿瘤抗原NLS基因片段融合。

本发明进一步提供了载体蛋白His6-H4-NLS的制备方法，具有工艺简单、安全、无毒。

本发明提供的载体蛋白His6-H4-NLS，其氨基酸序列如下：SEQno.1。

本发明所述的载体蛋白His6-H4-NLS的基因的获取方法，包括以下步骤：

1）提取全小麦基因组；

2）以小麦全基因组为模板设计引物，并在上游引物上添加NcoⅠ酶切位点，用于原核表达载体构建；

所用引物为：

上游引物1：

GCAGCGGCCTGGTGCCGCGCGGCAGCCATATGGCTAGCATGTCCGGGCGCGGCAAGGGAGG

上游引物2：

TATACCATGGGCAGCAGCCATCATCATCATCATCACAGCAGCGGCCTGGTGCC

下游引物1：

AGCAAGCTTATGGTTTCTTCTTTGGCTGGGGGCCGCCGAAGCCGTAGAGGGTGCG

以小麦全基因组为模板，用上游引物1和下游引物1，PCR法扩增得到小麦组蛋白H4-NLS基因序列的PCR产物；再以此PCR产物为模板，以上游引物2和下游引物1，扩增获得编码His6-H4-NLS基因的PCR产物；

3）将His6-H4-NLS基因序列的PCR产物用NcoⅠ和HindⅢ双酶切，获得NcoⅠ-His6-H4-NLS-HindⅢDNA片段，将该DNA片段构建入原核表达载体pET28a中NcoⅠ和HindⅢ双酶位点之间，获得编码载体蛋白His6-H4-NLS的原核表达载体。

本发明所述载体蛋白His6-H4-NLS的制备方法，包括以下步骤：

1）载体蛋白His6-H4-NLS的原核表达

将编码载体蛋白His6-H4-NLS的原核表达载体质粒导入到BL21（DE3）原核表达菌体系，37℃终浓度0.1mMIPTG诱导表达载体蛋白；

2）载体蛋白His6-H4-NLS原核表达产物纯化