[发明专利]一种具有抑制癌细胞增殖作用的胶原蛋白活性肽的制备方法

说明书

本发明公开一种具有抑制癌细胞增殖作用的胶原蛋白活性肽的制备方法，通过木瓜蛋白酶和胰蛋白酶的水解以及特定的纯化工艺，获得胶原蛋白活性肽。该胶原蛋白活性肽具有抑制癌细胞增殖的作用，如卵巢癌细胞，包括SKOV3、OVCAR3、436和SRO82，前列腺癌细胞，包括PC3、LnCAPC1、LnCAPC2。

技术领域

本发明涉及蛋白和多肽制备领域，更具体地，涉及胶原蛋白肽的领域。

背景技术

癌症是人们死亡的主要原因之一。在身体组织中，细胞分化属于生理过程，在正常的生理环境下，细胞的增殖和死亡保持一定的平衡。外界环境如射线、空气污染等会导致人体DNA发生突变，从而打破人体正常的调控过程导致癌症的产生。无论在细胞层面还是基因层面，癌症产生的过程中细胞承受不可控的分化，形成恶性肿瘤并扩散至身体其他部位。美国癌症学会预计：2015年，美国将新增21,290例卵巢癌病例，约14,180名妇女死于卵巢癌。卵巢癌在女性死亡率中位列第五，超过其他的女性生殖系统疾病。女人一生中患卵巢癌的风险是1/75，死于卵巢癌的概率是1/100(统计数据中不包含低恶性的卵巢肿瘤)。

食品来源的生物活性肽代表一类能促进人类健康的资源，由于这些活性肽可以在胃肠消化过程中被吸收，并产生活性，进而为预防或治疗慢性疾病提供新的应用。近年来，多肽已经被公认为具有生物活性，比如调节免疫，抗微生物，抗高血压，抗血栓形成，抗癌，抗氧化和降低胆固醇活性，这些活性多肽来源于牛奶，麦子，大豆，鸡蛋，鱼蛋白等植物和动物，通过酶水解法或发酵法制备。

Takashi等研究发现猪皮明胶能够抑制K-562，HCT15和AGS细胞的增殖(TakashiKojima et al.,2003,CANCER BIOTHERAPY&RADIOPHARMACEUTICALS,18(2):147-155)。G.A.Castro等考察了乳清分离蛋白和胶原水解物对黑素瘤癌细胞B16F10的生长抑制作用和对细胞周期的影响，结果表明乳清分离蛋白和胶原水解物对于B16F10细胞具有明显的生长抑制作用，半数抑制浓度IC₅₀在0.19～156.9mg/mL之间，牛胶原水解物对于B16F10细胞作用的半数抑制浓度IC₅₀低于1mg/mL(G.A.Castroet al.，2009，Journal of DermatologicalScience，56：51-57)。经过高温灭菌的黄鲫鱼经胃酶水解的产物对人前列腺癌细胞DU145具有抑制增殖作用，IC₅₀为13.67mg/mL，对人肺癌细胞1299的半数抑制浓度IC₅₀为25.17mg/mL(Ru Song et al.，2011，Mar.Drugs，1142-1156)。泥鳅经木瓜蛋白酶水解后的产物对肝癌细胞HepG2，乳腺癌细胞MCF-7和直肠癌细胞Caco-2的增殖具有抑制作用，当蛋白浓度达到40mg/mL时，HepG2和MCF7的增殖率仅为对照组(不加多肽组)的7％和4％(Lijun You etal.，2011，Journal of Agricultural and Food Chemistry，59:7948-7953)。

从鯷鱼酱分离出的疏水肽对淋巴瘤细胞U937增殖具有抑制作用，肽的氨基酸组成为丙氨酸和苯丙氨酸，分子量为440.9Da(Young Gon Lee et al.，2004，BioFactors,21：63-67)。金枪鱼酱汁水解物对于人乳腺癌细胞MCF-7的增殖具有抑制作用，经超滤膜分离的分子量大于2500Da的组分对MCF-7的增殖具有更高的抑制率，IC₅₀为1.39mg/mL，采用多种色谱手段对产物进行分离纯化，得到两个抗癌活性肽，并对其测序，肽的序列为KPEGMDPPLSEPEDRRDGAAGPK(2449.292Da)和KLPPLLLAKLLMSGKL LAEPCTGR(2562.405Da)(Chuan-Chuan Hung et al.,2014,Journal of Functional FoodsⅡ，http://dx.doi.org/10.1016/j.jff.2014.08.015)。