[发明专利]纳米银增强的比率型FRET探针及其制备方法与应用

权利要求书

1.纳米银增强的比率型FRET探针，其特征在于，它以直径为50nm的十面体纳米银为内核，十面体纳米银外表面键合有三种核酸链；

其中，

A链为：

A-FITC：5′-SH C6-AAAAAAAAAAAGGTACGGATCTGCG-FITC-3′；或者

A-Alex Fluor 488：5′-SH C6-AAAAAAAAAAAGGTACGGATCTGCG-Alex Fluor 488-3′；

B链为：5′-GTGCCGTAGCCTGCGCAGATCCGTACCT-3′

C链为：5′-Cy3-CAGGCTACGGCACGTAGAGCATCACCATGATCCTG-BHQ-2-3′。

2.权利要求1所述的纳米银增强的比率型FRET探针的制备方法，其特征在于，它包括如下步骤：

(1)将柠檬酸钠、聚乙烯吡咯烷酮、L-精氨酸、硝酸银加入至高纯水中，然后加入硼氢化钠混合均匀，其中柠檬酸钠、聚乙烯吡咯烷酮、L-精氨酸、硝酸银、硼氢化钠的摩尔比为(1～99)∶(0.1～9)∶(0.1～9)∶(0.1～9)∶(1～99)，高纯水的质量是聚乙烯吡咯烷酮质量的100～999倍，置于12W-120W的蓝色LED灯下照射6-94h得到十面体的纳米银Ag₁₀NPs溶液；

(2)将A链、B链、C链按摩尔比(1～99)∶(1～99)∶(1～99)加入步骤(1)得到的Ag₁₀NPs溶液中，A链、B链、C链三条链的总体积与Ag₁₀NPs的体积为之比为1∶(10-100)；

(3)向步骤(2)得到的混合体系中加入1～5mol/L氯化钠溶液，静置2～4小时，重复加入氯化钠溶液与静置的步骤1～4次，使得氯化钠的终浓度为0.1～0.3mol/L；

(4)将步骤(3)得到的混合体系静置6～24小时；

(5)将步骤(4)得到的溶液经离心去除上清，取沉淀加入1×PBS缓冲溶液重悬，重复离心与重悬的步骤2～4次，1×PBS缓冲溶液每次的加入体积为待加入的混合体系体积的0.1～5倍；最后离心得到的沉淀用1×PBSM缓冲溶液重悬即得备用探针。

3.根据权利要求2所述的纳米银增强的比率型FRET探针的制备方法，其特征在于，步骤(5)中，所述的离心的条件为6000～15000rpm条件下离心8～20分钟。

4.权利要求1所述的纳米银增强的比率型FRET探针在制备检测PDGF-BB的试剂中的应用。

5.一种用于检测PDGF-BB的试剂盒，其特征在于，该试剂盒包含如下试剂：权利要求1所述的纳米银增强的比率型FRET探针、磷酸盐缓冲液、PDGF-BB蛋白、牛血清白蛋白、96孔荧光板。

6.权利要求5所述的用于检测PDGF-BB的试剂盒在检测PDGF-BB中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，利用检测PDGF-BB的试剂盒检测PDGF-BB含量的具体方法，依次顺序包括如下步骤：

(1)配制溶液：

缓冲溶液：将20×PBS用二次水稀释20倍至1×PBS，然后加入1mM氯化镁制备得到1×PBS；将1×PBS稀释10倍成为0.1×PBS，然后加入0.3M氯化钠和1mM氯化镁制备得到0.3M PBSM；将0.1g牛血清白蛋白溶解于100mL 1×PBS溶液中得到1mg/mLBSA，加入1mM氯化镁得到1mg/mL BSAM溶液；在0.3M PBSM溶液中加入1mg/mL BSA得到0.3M BSAM；

阴性对照：1mg/mLBSA；

权利要求1所述的纳米银增强的比率型FRET探针；

(2)将比率型FRET探针分别与不同浓度的PDGF-BB溶液以及待测样本混合反应50分钟；

(3)用BioTeK酶标仪直接扫描，激发波长为470nm，发射波长为515nm和565nm，通过同时计算515nm和565nm的荧光强度比值来定量分析目标蛋白质的浓度，不同浓度的PDGF-BB溶液对应不同的比值，得到PDGF-BB标准曲线，由标准曲线计算得到样品中PDGF-BB的浓度。