[发明专利]一种测定大豆疫霉菌对大豆品系Chapman（Rps3a）的毒性的分子方法

权利要求书

1.一种测定大豆疫霉菌对大豆品系Chapman（Rps3a）的毒性的分子方法，其特征在于：包括以下步骤：

步骤一、提取待检测大豆疫霉菌的基因组DNA；

步骤二、设计特异性引物AVR3A1F/AVR3A1R，以提取的基因组DNA为模版，进行PCR扩增，扩增出含有完整无毒基因Avr3a的DNA片段；所述特异性引物AVR3A1F/AVR3A1R的碱基序列为：

AVR3A1F：5ˊ-ATCGAAGCCATATATCTACAGG-3ˊ；

AVR3A1R：5ˊ-CCTACTGTATGCAAAGTGATCG-3ˊ；

步骤三、用限制性内切酶Bpu10I酶切扩增出的DNA片段，得到酶切产物；

步骤四、对酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，得到酶切产物的琼脂糖凝胶电泳图；观察酶切产物琼脂糖凝胶电泳图，如果在250bp-500bp范围内有2条DNA条带，则对应的待检测大豆疫霉菌菌株相对于大豆品系Chapman（Rps3a）为无毒菌株；如果酶切后在750bp以下只有1条DNA条带，则对应的待检测大豆疫霉菌菌株相对于大豆品系Chapman（Rps3a）为毒性菌株。

2.根据权利要求1所述的一种测定大豆疫霉菌对大豆品系Chapman（Rps3a）的毒性的分子方法，其特征在于：步骤一所述提取待检测大豆疫霉菌基因组DNA的方法为CTAB法。

3.根据权利要求2所述的一种测定大豆疫霉菌对大豆品系Chapman（Rps3a）的毒性的分子方法，其特征在于：所述CTAB法提取待检测大豆疫霉菌基因组DNA的具体步骤为：

（1）从培养5-7天的待检测大豆疫霉菌菌落边缘切取10-20块直径2×2mm菌丝块，移入装有100mL澄清的10% V8液体培养基的三角瓶中，置于25℃黑暗条件下、120 r/min震荡培养5-7天，培养好的菌丝体用灭菌双层纱布过滤收集，蒸馏水冲洗1次，经冷冻干燥后充分捣碎成菌丝粉；所述的10% V8液体培养基指用蒸馏水稀释10倍的美国Campbell公司生产的V8蔬菜汁；

（2）取50mg的菌丝粉于1.5mL EP管中，加入900μL质量浓度为2%的CTAB提取液和90μL质量浓度为10%的SDS水溶液后漩涡混合器上充分混匀；

（3）55-60℃水浴1h， 每15min振荡混匀一次；

（4）12000 r/min离心10min，取上清液A，加入苯酚、氯仿和异戊醇三者的混合物抽提1次，所加入的苯酚、氯仿和异戊醇三者的混合物中苯酚、氯仿和异戊醇的重量比为25:24:1，苯酚、氯仿和异戊醇三者混合物的体积与上清液A的体积相等；

（5）12000 r/min离心10min，吸取上清液B，加入氯仿抽提1次，所加入氯仿的体积与上清液B的体积相等；

（6）12000 r/min离心10min，吸取上清液C，加入3mol/L的NaAc水溶液和冰无水乙醇过夜沉淀基因组DNA，所加入NaAc水溶液和冰无水乙醇与上清液C的体积比为0.1:2:1；

（7）用预冷的体积比为70%的乙醇水溶液洗涤两次，然后置于37℃条件下干燥；

（8）干燥后的DNA用100μL含50μg/mL核糖核酸酶的ddH₂O溶解，37℃静置1h后，置于-20℃冰箱中备用。

4.根据权利要求1所述的一种测定大豆疫霉菌对大豆品系Chapman（Rps3a）的毒性的分子方法，其特征在于：所述PCR扩增的扩增体系和扩增条件分别为：

扩增体系：稀释10倍的PCR反应缓冲液，2.5μL；2.5mmol/L的MgCl₂，1.5μL；2.5mmol/L的dNTPs，0.5μl；5U/μL的Taq DNA聚合酶，0.2μL；10μmol/L的特异性引物AVR3A1F和AVR3A1R各0.5μL；模板DNA，0.5μL；加无菌超纯水至25μL；

扩增条件：95℃变性30S，60℃退火30S，72℃延伸30S，30个循环，72℃延伸5min。