[发明专利]一种二/三甲基化肽段富集和质谱分析的方法

权利要求书

1.一种二/三甲基化肽段富集和质谱分析的方法，其特征在于，利用生物素化试剂（EZ-NHS-biotin）基团能够与未修饰（Kme0）或者单甲基化（Kme1）（记为Kme0/1）修饰的赖氨酸发生特异性反应而不会与二、三甲基化（Kme2/3）修饰的赖氨酸反应的特点，通过亲和素偶联的琼脂糖微球去除Kme0/1修饰的赖氨酸肽段，对Kme2/3修饰的赖氨酸肽段进行富集；具体步骤为：

（1）蛋白生物素化修饰：基于N-羟基琥珀酰亚胺与赖氨酸侧链氨基的高效反应，采用生物素化试剂（EZ-NHS-biotin），通过化学反应将生物素基团引入赖氨酸Kme0/1上，实现蛋白样品中赖氨酸Kme0/1的高效生物素化修饰；

（2）蛋白沉淀：向经步骤（1）生物素化修饰的蛋白样品加入丙酮，过夜，沉淀蛋白，同时去除过量的生物素化试剂；

（3）蛋白酶解：向经步骤（2）处理的蛋白中加入胰蛋白酶，胰蛋白酶和蛋白的质量比1:40-60，充分混合，35-39摄氏度酶切14-16小时，使蛋白完全酶解成氨基酸长度在10-20之间的的肽段；

（4）亲和素去除生物素修饰肽段：用缓冲液稀释肽段至1-1.5ml，用亲和素偶联的琼脂糖微球为吸附剂，利用亲和素和生物素之间的高亲和能力，将生物素化的Kme0/1吸附到亲和素偶联的琼脂糖微球上，亲和吸附过程在2-6摄氏度条件下进行，时间2-4小时，充分去除发生生物素修饰的Kme0/1修饰肽段；

（5）质谱分析：600-1200g离心后取上清，通过除盐柱富集上清中的肽段，冻干，然后进行质谱检测。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中所述蛋白样品用缓冲液提取细胞全蛋白得到，蛋白样品浓度为1ug/μL~5ug/μL；所述采用生物素化试剂（EZ-NHS-biotin），通过化学反应将生物素基团引入赖氨酸Kme0/1上，是在蛋白样品中，加入5-30mM的碳酸氢氨，同时加入等体积5-30mM的EZ-NHS-biotin，在35-39摄氏度下避光混合，使样品中的Kme0/1修饰的赖氨酸被充分被生物素化。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中蛋白沉淀的操作过程为：在向所述蛋白样品中加入5-10倍体积的预冷丙酮，-10-30摄氏度过夜；11000-15000g离心20-40分钟后得到蛋白沉淀，用预冷丙酮洗2-4次，完全去除生物素化试剂。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，先用6-10M尿素重溶步骤(2)中得到的蛋白沉淀用缓冲液稀释至0.5-2M尿素；然后加入胰蛋白酶，进行酶解。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(4)中，琼脂糖微球材料与所富集肽段的体积质量比为50-200ul/1mg。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(4)中，先对亲和素偶联的琼脂糖微球用缓冲液进行清洗，重复2-3次。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(5)的操作过程为：合并步骤（4）中所得到的上清和清洗液；然后除盐、冻干；再重溶于0.05-0.2%FA中；最后进行LC-MS/MS分析。