[发明专利]利用PRSS2基因作为乳蛋白含量分子标记的检测方法

说明书

本发明公开了一种利用PRSS2基因作为乳蛋白含量分子标记的检测方法，具体为：第一步；采取牛的血液进行全基因组DNA的提取，利用琼脂糖凝胶电泳的方法，检查DNA的质量；第二步：以全基因组DNA为模板，以引物A为引物进行PCR扩增牛PRSS2基因片段；第三步：用全基因组DNA进行混池PCR，找到多态性的位点，第四步：对单个样品进行测序，根据测序结果进行多态性关联分析；有益效果：发现了5个SNP位点与牛的乳品质中乳蛋白性状的相关性。提供了一种简单，快速的在DNA水平上筛查和检测与牛乳品质性状密切相关的遗传标记，可应用于牛的分子育种。解决了SSCP、PCR—PFLP技术的繁琐性，提高了准确性和精确度。

技术领域

本发明涉及一种乳蛋白含量分子标记的检测方法，特别涉及一种利用PRSS2基因作为乳蛋白含量分子标记的检测方法。

背景技术

单核苷酸多态性(SNP)是指在基因组上单个核苷酸的变异—A，T，C或是G的变异从而引起DNA序列的改变，造成不同物种之间染色体基因组的多态性。这种基因组上的单个核苷酸的变异(包括置换、颠换、缺失、插入)形成的遗传标记，其数量较多，多态性也很丰富。一般来说，SNP是指变异频率大于1％的单核苷酸变异。在基因组DNA中任何碱基均有可能发生变异，因此SNP既有可能在基因序列即在编码区内，也有可能在非编码序列上。但出现在编码区的cSNP(coding SNP)相对较少，其变异率仅仅是非编码区变异的1/5，但对于cSNP在遗传学的研究中是非常重要的。从对生物的遗传性状的影响上来看，cSNP分为同义cSNP(synonymous cSNP)和非同义cSNP(non-synonymous cSNP)，同义cSNP是指SNP所造成的编码序列的改变并不影响其所翻译的蛋白质的氨基酸序列的改变，而非同义cSNP是指碱基序列的改变造成翻译的蛋白质氨基酸序列的改变，从而影响蛋白质的功能。在人类的基因组中大约每1000个碱基就有一个SNP位点，同时分布广泛，适于快速、规模化筛查，易于检测和基因分型等，因此SNP成为第三代遗传标记，充分在动物遗传、群体遗传研究、基因定位及基因育种，以及关联分析等方面发挥着重要的作用。同时也在分子遗传、药物药理、疾病的诊断和治疗等方面发挥着重要作用。

SNPs的检测主要有DNA直接测序，PCR-RFLP，以及单链构象多态技术(SSCP)等。其中，DNA直接测序的方法简单、准确，很适合大群体样本的检测。

PRSS2(protease,serine,2)基因是属于胰蛋白酶家族中以丝氨酸为活性中心的重要的蛋白水解酶，在生物有机体中发挥着广泛重要的作用，通过对蛋白酶原的激活或是抑制而进行调节，编码阴离子胰蛋白酶原。又称为TRYP8，是由胰腺合成的最丰富的分泌蛋白之一。它与阳离子胰蛋白酶原(PRSS1)数量的比值是1:2。丝氨酸蛋白酶超家族的成员较多而且分布较广，他们的活性部位都含有Ser，His，Asp，但是它们与底物的结合部位的差异决定了各自对底物的专一性，正是因为在结构上的微小变化造成了功能上的差异。有研究表明，丝氨酸蛋白酶在心血管疾病的治疗上也发挥了重要的作用。纳豆激酶具有纤溶活性是由纳豆芽孢杆菌产生的，可直接作用于交联纤维蛋白，增加纤溶酶的活性。大部分的蛇毒丝氨酸蛋白酶对凝血、纤溶系统起到重要作用。而从蚯蚓提取的蚯蚓纤溶酶有溶解血栓又有抑制新血栓形成的作用。更有研究表明胰蛋白酶原2即PRSS2与多种恶性肿瘤密切相关，也被称为肿瘤相关胰蛋白酶原(PRSS2)，多种恶性的肿瘤细胞株都能表达该蛋白，其表达也与肿瘤的侵袭和转移有关，PRSS2是基质金属蛋白酶(MMP)的激活物，能激活间质胶原酶，促进肿瘤细胞的侵袭和转移。同时PRSS2蛋白能够激活蛋白酶激活受体，促进肿瘤的生长发育。也有研究表明PRSS2与胰腺疾病有密切关系。因此研究该基因的功能好调控作用机制成为遗传学研究的热点，进而对PRSS2基因的研究具有着重要的意义，目前对其在奶牛为对象的研究还相对较少，而有关PRSS2基因与奶牛性状的相关性目前还少有报道。