[发明专利]一种CHO细胞收获液的前处理方法

说明书

技术领域

本发明涉及单抗纯化领域，具体来说，涉及一种CHO细胞收获液的前处理方法。

技术背景

在现代生物制药领域中，利用动物细胞培养技术生产的单克隆抗体对医疗卫生事业的发 展起着越来越重要的作用。CHO细胞培养收获液经过澄清、过滤、纯化制剂等步骤，制得单 克隆抗体。然而，细胞收获液中所包含的细胞碎片、宿主细胞蛋白(HCP)、DNA、单抗多聚 体(HMW)等杂质，不仅加大了澄清过滤的难度，而且还会增加下游纯化处理的成本。细胞收 获液的前处理常用方法包括：两级深层膜过滤技术或离心分离结合一级深层过滤技术。深层 过滤膜价格非常昂贵，且过滤通量也较低，因此分离CHO细胞培养液的膜过滤成本非常高。 由于膜过滤后料液浊度、HCP、DNA等杂质浓度很高，料液在过ProteinA柱时对填料使用 寿命的损害大，使得下游纯化的成本较高。

目前，已有文献报道通过向细胞收获液中添加絮凝剂或助滤剂、调节溶液pH值，能够降 低浊度及收获液中核酸的含量，但是并不能同时优化浊度、DNA、HCP、HMW和膜通量。 在前处理过程中去除更多的杂质和优化更多参数的方法，对于抗体工程的表达生产具有实际 经济效益。

发明内容

针对现有技术存在的缺陷或不足，本发明的目的是提供一种CHO细胞收获液的前处理方 法，在细胞收获液的前处理阶段去除更多的杂质，有利于减少后续纯化的压力，也压缩了成 本。

具体的，本发明提供了一种CHO细胞收获液的前处理方法，包括以下步骤：

1)将含壳聚糖和丙氨酸的混合溶液加入到细胞收获液中，调节收获液pH为5～7；

2)将氯化钙加入到细胞收获液中，搅拌后离心过滤。

在一些实施方式中，收获液中壳聚糖的浓度为0.6～0.8g/L。

在一些实施方式中，壳聚糖是非水溶性壳聚糖。

在另一些实施方式中，非水溶性壳聚糖为医药级壳聚糖，脱乙酰度大于95％。使用时可 以使用稀硫酸或稀盐酸来先溶解非水溶性壳聚糖。

在一些实施方式中，收获液中丙氨酸的浓度为0.1～1g/L。

在一些实施方式中，收获液中氯化钙的浓度为3～6g/L。

在一些实施方式中，步骤1)前处理时收获液适合的pH为5～6。

本发明方法的技术有益效果如下：

(1)本方法工艺简单，发酵液通过本方法处理后，收获液离心后的浊度降低至30NTU 以下；

(2)收获液DNA浓度降低了95％以上，宿主细胞蛋白HCP浓度降低50％以上，HMW 比例降低了60％以上。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例子仅为了阐明本 发明，而非为了限制本发明的应用范围。

本发明以下实施例中的CHO细胞(中国仓鼠卵巢细胞)细胞株购自invitrogen公司；表 达重组人肿瘤坏死因子受体-Fc重组蛋白(rhTNFR-Fc)抗体所用的细胞株为自主构建。本发明 实施例中rhTNFR-Fc抗体是基于专利US2005/0069979A发酵制备而来。

实施例1

向1L收获液中添加壳聚糖0.6g，丙氨酸0.1g，用0.8M盐酸调节pH值为5.0后，向收 获液中添加氯化钙3g。将上述收获液在15℃下搅拌30分钟，15℃、4000×g离心15分钟， 测浊度，检测初步分离料液中DNA浓度及ProteinA步骤后料液中HCP浓度和HMW的百分 含量，检测方法如下，结果见表1。

DNA、HCP和HMW三者的检测方法：

DNA检测采用实时荧光定量PCR法。酶激活和预变性条件是95℃，5min。PCR反应条 件是95℃，15s；60℃，60s；40个循环。

HCP检测采用夹心ELISA方法。转速180rpm，孵育温度37℃，OD值检测波长450/630 nm。

HMW采用高效液相色谱法。色谱柱TSK-gelG3000SW7.8*300mm(5μm)，流动相150 mM磷酸盐缓冲液，100％A相，流速0.5ml/min，温度25℃，pH7.0，检测时间30min，波 长280nm。

实施例2