[发明专利]莱茵衣藻Dof基因的重组表达载体及其构建方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及植物基因工程的技术领域，具体涉及一种莱茵衣藻Dof基因的重组表达载体及其构建方法和应用。

背景技术

随着化石能源的大量消耗，生物能源的发展逐渐受到重视。生物柴油与化石燃料相比具有可再生、不污染环境等优势。生产生物柴油的原料从一开始的高等陆地植物，近几年转变为微藻。因为微藻在众多原料中具有不占用耕地、产油率高的突出特点。微藻体内的三酰甘油(triacylglycerol,TAG)等化合物可以用于生产生物柴油，部分产油微藻的含油量非常高，Botryococcusbraunii中油脂含量为57％-64％，Neochlorisoleoabundans中油脂含量为35％-65％，而Schizochytriumsp.中的油脂含量最高可达77％。

莱茵衣藻(Chlamydomonasreinhardtii)与其它藻种相比，它作为一种模式生物，基因组测序已经完成，近些年来成为生物柴油的研究热点，它的培养条件简单，繁殖迅速，生长周期仅为十天，藻细胞浓度最高可达1×10⁷个/ml。有自养和异养两种营养模式。在微藻中，自由脂肪酸在质体中合成后，被运送到细胞质中，在细胞质的内质网上经过一系列酰基化作用与甘油组装成三酰甘油(TAG)。甘油三磷酸合成的最后一步酶为甘油三磷酸酰基转移酶(G3PDH)，它负责将糖代谢的中间产物磷酸二羟基丙酮(dihydroxyacetonephosphate)催化成甘油三磷酸(Gly3P)。生成的甘油三磷酸在甘油三磷酸酰基转移酶(GPAT)的催化下，酰基化成溶血磷脂酸(lysophosphatidicacid)，接着被溶血磷脂酸酰基转移酶(lysophosphatidicacidacyltransferase，LPAAT)进一步酰基化，生成磷脂酸。随后磷脂酸在磷脂酸磷酸水解酶(phosphatidicacidphosphohydrolase)的催化下去磷酸化，生成二酰甘油(DAG)。最后，二酰甘油脂肪酰转移酶(DAGAT)将DAG催化成TAG。资料查阅得知，一些研究致力于改变培养基成分来提高微藻脂肪酸含量，但这种方法使得细胞生长受到抑制，无法更多的提取油脂。通过基因工程改造的方法更符合实际，如何确定微藻中基因对油脂含量的影响，同时不影响微藻生长状况，成为研究重点。目前，关于微藻产油的研究已经有很多报道，Trentacosteetal.通过敲除一个有磷脂酶、脂肪酶和脂肪酰基转移酶的多功能基因，使得Thalassiosirapseudonana藻的中性脂含量增加。Niuetal.发现过表达Phaeodactylumtricornutum藻中的酰基辅酶A基因：二酰基甘油酰基转移酶基因(diacylglycerolacyltransferasegene)，可显著增加油脂生物合成量。XiaodongDeng2发现通过RNAi干扰莱茵衣藻柠檬酸合酶(CrCIS)，莱茵衣藻内三酰甘油(TAG含量)增加169.5％。DengXetal利用RNAi干扰技术使pepc1和pepc2基因沉默后，莱茵衣藻(C.reinhardtii)的油脂含量分别提高了14～28％和20％。Lv.Het利用基因敲除技术抑制溶血磷脂酸酰基转移酶(LPAAT)的表达后，中性脂含量降低了20％。Hwangbo,Ketal发现过表达硬脂酰ACP脱氢酶(stearoyl-ACPdesaturase)莱茵衣藻(C.reinhardtii)的油酸含量增加2.4倍，总脂含量增加28％。Masokolwaietal发现过表达甘油二酯酰基转移酶(DGTT4)，莱茵衣藻(C.reinhardtii)TAG总量增加1.5-2.5倍。丁宓等人利用miRNA技术,沉默莱茵衣藻淀粉代谢途径中STA6、SSS2和AMYB1基因，莱茵衣藻转化株amiR-AMYBI中性脂含量增加最高30％。GabrielO.Jamesetal采用缺陷ADP-葡萄糖焦磷酸化酶的小亚基-BAFJ5,使得莱茵衣藻(C.reinhardtii)中性脂增加4.3-7倍；总脂增加2.3-3.1倍；中性脂/干重增加至32.6％；总脂/干重增加至46.4％；中性脂/总脂增加至71％。