[发明专利]一种基于人源骨架蛋白Fn3制备脑钠肽前体抗原替代物的方法

说明书

本发明公开一种应用人源骨架蛋白Fn3(人纤维连接蛋白fibronectin 3)展示抗原表位用于制备脑钠肽前体N端(NT‑proBNP)线性表位的方法。该方法通过基因重组，将能与抗脑钠肽前体抗体结合的抗原表位核苷酸序列置换骨架蛋白Fn3的编码FG区的核苷酸序列，构成骨架蛋白Fn3与NT‑proBNP线性表位融合基因，利用大肠杆菌表达系统高效表达、制备骨架蛋白Fn3融合NT‑proBNP线性表位的融合蛋白。本发明的有益效果是可以简单、快速、高效制备具有和脑钠肽前体的抗原性相当的融合蛋白，为高效低成本制备具有脑钠肽前体抗原性的标准品奠定基础。

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种表达、分离纯化人源Fn3展示抗原脑钠肽前体N端 (NT-proBNP)线性表位的方法，可以简单、快速、高效制备具有和脑钠肽前体的抗原性相当的融合蛋白， 即脑钠肽前体抗原替代物。为高效低成本制备具有脑钠肽前体抗原性的标准品奠定基础。

背景技术

在ELISA检测试剂盒制备过程中，需要相应的抗原作为标准品。其中，蛋白质类抗原占有很大的比例。如何高效生产蛋白质类抗原蛋白，是该类产品的一个技术关键。本发明采用人源骨架蛋白Fn3展示蛋白质类抗原线性表位，尝试建立一个利用大肠杆菌高效生产蛋白质类线性表位的通用的平台。

骨架蛋白是一类构成蛋白质骨架部分的能够耐受多个氨基酸插入、缺失或替换而保持其折叠和三级结构不变的蛋白质骨架。来源于一些蛋白质结构非常稳定的结构域。该类蛋白具有高度稳定性和可溶性，易于在大肠杆菌种高水平表达。其中研究非常深入的人纤维连接蛋白III型结构域(Fn3)是一种骨架蛋白。Fn3包含94个氨基酸残基，分子量13.8kD，不含半胱氨酸和二硫键，由四条β-折叠和一条α-螺旋组成。Fn3具有非常高的热稳定性，Tm值高达87℃，其热变性过程完全可逆。除此之外，Fn3能够耐受高浓度的尿素；且在室温条件下，pH值在2-11.3的范围内仍然能保持蛋白质的天然构象。这个蛋白非常适合作为融合蛋白在大肠杆菌种表达纯化。

抗原表位(antigenic epitope)，简称“表位”，也称为“抗原决定簇”(antigenicdeterminant)，是指抗原表面上决定抗原特异性的化学基团。抗原表位可被免疫系统(尤其是抗体、B细胞或者T细胞)所识别。抗体中能识别抗原表位的区域叫做“互补位”或“抗体决定簇”。通常抗原表位是指外来蛋白质等物质的其中一部分序列。蛋白质抗原的表位根据它们的结构以及与互补位的交互作用，被分为构象表位和线性表位这两种类型。其中线性表位是由一段连续的抗原氨基酸序列构成，与抗原的结合作用的基础是其一级结构，是蛋白质抗原性的基础，抗体的特异性是针对表位的。由于表位一般仅由几个到十几个氨基酸组成，合成单独的抗原表位肽由于其分子较小，极难表达纯化。

本发明采用人源骨架蛋白Fn3展示脑钠肽前体抗原表位，通过该途径解决一些抗原在大肠杆菌种表达困难或抗原不稳定的问题，实现只表达骨架蛋白所展示抗原的一个或多个表位，就可以生产具有和抗原蛋白具有等效的高稳定的抗原蛋白替代物。

发明内容

本发明建立基于人源Fn3展示抗原脑钠肽前体N端(NT-proBNP)线性表位来制备脑钠肽前体抗原替代物的方法，可以简单、快速、高效制备具有和脑钠肽前体的抗原性相当的融合蛋白，即脑钠肽前体抗原替代物。为高效低成本制备具有脑钠肽前体抗原性的标准品奠定基础。

选取编码能与抗脑钠肽前体抗体结合的抗原表位核苷酸序列置换骨架蛋白Fn3的编码FG 区的核苷酸序列，利用大肠杆菌表达系统制备和脑钠肽前体N端(NT-proBNP)的抗原性相当的融合蛋白。

一种基于人源骨架蛋白Fn3制备脑钠肽前体抗原替代物方法，包括以下步骤：

1、骨架蛋白Fn3展示NT-proBNP线性表位重组蛋白表达载体构建：