[发明专利]大豆异黄酮组分提取及测定方法

说明书

技术领域

本发明属于农作物提取技术领域，具体涉及一种大豆异黄酮组分提取及测定方法。

背景技术

大豆异黄酮是黄酮类化合物，是大豆生长过程中形成的一类次级代谢产物，是一种生物活性物质。由于是从植物中提取，且与雌激素有相似结构，因此，大豆异黄酮又称植物雌激素。大豆异黄酮的雌激素作用影响到激素分泌、代谢生物学活性、蛋白质合成、生长因子活性等，是天然的癌症化学预防剂。随着人们生活水平的提高，对天然生物活性物质的需求正逐渐增大，大豆异黄酮对人体生理代谢有益的调节作用及丰富的大豆资源，为其开发利用展示了广泛的市场前景，目前正越来越受到世界各国的关注。大豆异黄酮是多酚类混合物，大豆异黄酮的组成、存在形式主要包括染料木素、大豆黄素和黄豆黄素，天然情况下它们主要以7-0-葡萄糖甙形式存在。大豆提取物中大豆异黄酮的含量是产品质量的关键指标之一，也是大豆异黄酮产品研究开发中首先必需解决的问题。

我国大豆资源丰富，有很大的发展潜力。大豆在我国的可种植地区广泛，但是种植具有较强的区域性，俗话“百里不引豆”，因此，不同地区生产的大豆质量参差不齐，其异黄酮含量也有很大差异。目前，国家标准依据不同指标将大豆划分等级，但未对异黄酮的含量进行规定。不同等级的大豆价格差异大，鉴于异黄酮的高附加值，把异黄酮含量列入划分大豆等级的标准具有实际意义。因此，首先就需要建立一种简便、快捷的测定异黄酮含量的方法，目前的测定方法主要有比色法、纸色谱法、薄层色谱法、气相色谱法、HPLC法等，比色法干扰多，专一性差，测定结果偏差较大，并需要进行较为复杂的样品前处理；纸色谱法及薄层色谱法存在分离效果差，定量不准确等缺点，气相色谱法采用了样品衍生后进行测定，存在操作繁琐，条件不易控制、杂质干扰严重等问题。

发明内容

针对上述问题，本发明对大豆提取物中异黄酮组分的高效液相色谱测定方法进行了系统的研究，并对样品的前处理条件进行探索，提供了一种大豆异黄酮组分含量的测定方法，可有效测定大豆提取物中各异黄酮组分的含量，为大豆品质分级提供可靠的依据。

为解决以上技术问题，本发明通过以下技术方案实现：

设计一种大豆异黄酮组分提取方法，包括以下步骤：

（1）将大豆粉碎，过0.35μm筛，向所得大豆粉中加入20～30倍（优选25倍）于其重量的体积百分浓度为90%的甲醇溶液；

（2）将步骤（1）所得混合物于60～70℃条件下超声波处理70～80min，再以8000～12000rpm的离心速度离心4～6min，去除固余物，所得上清液即为大豆苷、黄豆黄苷和染料木苷的提取液；

（3）将步骤（1）所得混合物于60～70℃条件下机械震荡70～80min，再以8000～12000rpm的离心速度离心4～6min，去除固余物，所得上清液即为染料木素、黄豆苷元的提取液。

研究表明大豆异黄酮主要包括染料木素、大豆苷、黄豆黄苷、染料木苷，这几种成分可以表征出异黄酮含量的高低，并用以评价大豆品质高低。

设计一种测定大豆异黄酮组分含量的方法，包括以下步骤：

（1）制作异黄酮各个组分的标准曲线：

将异黄酮各个组分的标准品分别溶于无水甲醇中，作为标准溶液，并配置成一定的梯度浓度，再利用液相色谱分别制作出各组分对应的标准曲线；

（2）异黄酮组分测定

分别取权利要求1中步骤（2）和步骤（3）所得上清液送入液相色谱仪器，结合上步所得大豆苷、黄豆黄苷、染料木苷、染料木素、黄豆苷元的标准曲线，得到各组分含量。

液相色谱仪检测条件如下：色谱柱：安捷伦L1260，Eclipse XDB-C18-USP L1分析柱，规格（mm）：4.6×250，粒径：5μm；柱温：40～42℃；进样体积：10μL；保留时间：35min；流动相：0.1% (v/v)乙酸水溶液(A)和100%甲醇(B)；流速：1 mL/min；梯度洗脱：0～20 min、29～71% B(v/v)，20~20.01 min、70～90% B(v/v)，20.01～22 min、90～90% B(v/v)，22.0~22.01 min、90～30% B(v/v)，22.01～33.0 min、30～30% B(v/v)。

所述染料木素的检测波长：260nm，大豆苷的检测波长：248nm，黄豆黄苷的检测波长：257nm，黄豆苷元的检测波长：250nm，染料木苷的检测波长：260nm。