[发明专利]一种熊果酸复合益生菌的制备方法

权利要求书

1.一种熊果酸复合益生菌的制备方法，其特征在于具体制备步骤为：

（1）取80～90g苦丁茶，先将其放入50～60℃烘箱中干燥5～6h，将干燥后的苦丁茶研磨、粉碎，过筛得到80～100目苦丁茶粉末，按固液比1:10与质量分数90%乙醇混合，在80～90℃下回流提取2～3次，每次2～3h，回流结束后将提取液用0.25～0.30μm微孔滤膜过滤，得滤液；

（2）将上述滤液通过D-101树脂柱吸附，分别用水和质量分数20%乙醇溶液进行洗脱至无色，收集质量分数20%乙醇洗脱液，将洗脱液减压浓缩至原体积10%，即得熊果酸浓缩液；

（3）取15～20mL上述熊果酸浓缩液和50～80mL去离子水、8～12g柠檬酸氢二铵、8～12g磷酸二氢钾、15～18g牛肉膏、15～20g蛋白胨、3～5g硫酸镁混合，混合均匀后调节pH值为6.2～6.6，配制成发酵培养基，将发酵培养基在600～700W超声功率下超声处理10～15min，处理结束后过滤得滤液，向滤液中按体积比5:1加入质量分数20%的乙醇溶液，混合后得到含有熊果酸发酵培养基；

（4）分别选取10～15株乳酸菌菌株、5～8株双歧杆菌和6～10株嗜热链球菌接种上述含有熊果酸发酵培养基中进行培养，先在35～37℃下好养培养5～7h，再在38～40℃下厌氧培养10～15h；

（5）将上述培养完成后的培养液在4800～5000g离心分离12～15min，分离后收集菌体，并用pH为6.8磷酸盐缓冲液洗涤2～3次，将冲洗后的菌体再次加入pH为6.8的磷酸盐缓冲液中，调整菌数到2.3～3.8×10⁹CFU/mL，然后用超声波细胞粉碎机在300～350W和0～5℃冰浴条件下破碎处理8～10min，工作5s，间歇5s，将破碎后的悬浊液在6000～7000g离心分离15～20min，收集上清液，并进行减压蒸馏，回收溶剂，用质量分数35%盐酸调节浓缩液pH值为2.0～3.5，并置于0～5℃的水浴中，待固体完全析出后过滤，将过滤物重新溶于无水乙醇中重结晶，过滤，得过滤物即可。