[发明专利]高产细菌素的副干酪乳杆菌基因工程菌株的构建方法

权利要求书

1.高产细菌素的副干酪乳杆菌基因工程菌株的构建方法，其特征在于该方法按以下步骤进行：

一、从副干酪乳杆菌HD1.7中扩增prcK基因；

二、将prcK基因与pMD18-T载体连接构建质粒pMD18-T-prcK；

三、以表达质粒pRSFDuet-1为骨架，向质粒上的多克隆位点插入目的基因prcK，构建重组过表达载体pRSFDuet-1-prcK；

四、以表达质粒pRSFDuet-1-prcK为骨架，向质粒上的多克隆位点插入目的基因tet，构建重组过表达载体pRK-tet；

五、将过表达载体pRK-tet电转化副干酪乳杆菌HD1.7感受态细胞；

六、prcK基因过表达突变株的筛选和鉴定。

2.根据权利要求1所述的高产细菌素的副干酪乳杆菌基因工程菌株的构建方法，其特征在于步骤一中扩增prcK基因的引物为prcK-up和prcK-down，prcK-up引物序列为5’-CCGGAGCTCATGGAAACTTATTCTGATCTAGCCT-3’，prcK-down引物序列为5’-CCGCTGCAGATGATGATGATGATGATGTCATCTCCCTATAAACAAAGTGATC-3’。

3.根据权利要求1所述的高产细菌素的副干酪乳杆菌基因工程菌株的构建方法，其特征在于步骤一中扩增prcR基因PCR反应体系如下：

PCR反应程序为：

4.根据权利要求1所述的高产细菌素的副干酪乳杆菌基因工程菌株的构建方法，其特征在于步骤二中prcK基因与pMD18-T载体连接反应体系如下：

5.根据权利要求1所述的高产细菌素的副干酪乳杆菌基因工程菌株的构建方法，其特征在于步骤三中构建重组过表达载体pRSFDuet-1-prcK时，用限制性内切酶SacI和PstI对IpRSFDuet-1和pMD18-T-prcR分别进行双酶切。

6.根据权利要求1所述的高产细菌素的副干酪乳杆菌基因工程菌株的构建方法，其特征在于步骤四中tet基因是以pBR322为模板，以tet-up、tet-down引物PCR扩增得到的，PCR反应体系如下：

PCR反应程序为：

7.根据权利要求1所述的高产细菌素的副干酪乳杆菌基因工程菌株的构建方法，其特征在于步骤四中插入目的基因tet的连接反应体系为：

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