[发明专利]高产2,3-丁二醇的产酸克雷伯氏基因工程菌株的构建方法及其发酵方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种高产2,3-丁二醇的基因工程菌株的构建方法及其发酵方法。

背景技术

产酸克雷伯氏菌(Klebisellaoxytoca)作为2,3-丁二醇的产生菌，具有适应环境 能力强、底物范围广、代谢彻底、副产物较少、产物浓度和转化率较高等优点被认为是工业 化生产的潜在菌株。但是，酸性副产物乳酸的积累仍是限制2,3-丁二醇产量提高的主要因 素，发酵过程中乳酸含量的增加，会抑制菌体的生长，不但降低了2,3-丁二醇的产量，同时 增加了后续对2,3-丁二醇分离纯化的复杂性。

另外，还存在2,3-丁二醇转化率低、生产强度低及纯度低的技术问题。

发明内容

本发明是为了解决目前产酸克雷伯氏菌产2,3-丁二醇产量低、转化率低、生产强 度低及纯度低的问题，提供高产2,3-丁二醇的产酸克雷伯氏基因工程菌株的构建方法及其 发酵方法。

本发明高产2,3-丁二醇的产酸克雷伯氏基因工程菌株的构建方法，按以下步骤进 行：

一、ldh基因同源左臂片段ldh-L和右臂片段ldh-R的构建：

以产酸克雷伯氏菌HD79基因组DNA为模板，分别用ldh-L₁、ldh-L₂和ldh-R₁、ldh-R2 引物进行PCR反应；

二、pldh-L和pldh-R质粒构建：

向含有ldh基因同源左臂片段和右臂片段的PCR反应体系中加入0.25μLTaq(5U/μ L)DNA聚合酶，72℃水浴中反应10min，将目的条带胶回收纯化，获得片段ldh-L和ldh-R，将 片段ldh-L和ldh-R分别与pMD18-T载体连接，获得克隆载体分别命名为pldh-L和pldh-R；

三、pldh-LR质粒构建：

以pldh-L为骨架，选用限制性内切酶XhoI和EcoRI对质粒载体pldh-L与pldh-R 分别进行双酶切，用T4DNA连接酶将pldh-R的酶切产物连接到pldh-L质粒载体上，得到重组 质粒pldh-LR；

四、pT-Cm^r质粒构建：

以pGP704-Cm为模板，利用Cm-up和Cm-down为扩增引物，对Cm^r进行PCR扩增，对PCR 产物进行TA克隆，得到pT-Cm^r质粒；

五、同源重组片段ldhL-Cm^r-ldhR的构建：

以重组质粒pldh-LR为骨架，选用限制性内切酶XhoI对重组质粒pT-Cm^r和pldh- LR进行酶切，将获得的Cm^r片段插入质粒载体pldh-LR中，构建质粒载体pT-LCR；

选择限制性内切酶BamHI与BglII对重组质粒pT-LCR进行酶切，获得同源重组片 段ldhL-Cm^r-ldhR；

六、K.oxytocaHD79/pKD46菌株构建：

将质粒pKD46电转化到K.oxytocaHD79感受态细胞，得到K.oxytocaHD79/pKD46 菌株；

七、同源重组片段ldhL-Cm^r-ldhR转化K.oxytocaHD79/pKD46：

将同源重组片段ldhL-Cm^r-ldhR电转化到K.oxytocaHD79/pKD46中，得到的目的 菌株为高产2,3-丁二醇的产酸克雷伯氏基因工程菌株K.ocytocaHD79-01。

步骤一所述产酸克雷伯氏菌(K.oxytoca)HD79已在文献《Klebisellaoxytoca HD79乙酸激酶部分基因(ack)的克隆与序列分析》(中国农学通报，2015。31(14):83-88)中 公开。

上述方法构建的产酸克雷伯氏基因工程菌株的发酵方法，按以下步骤进行：

一、将产酸克雷伯氏基因工程菌株K.oxytocaHD79-01单菌落接种到种子液培养 基中，30℃，150r/min培养至对数生长期，得种子液；

二、然后将种子液以5％的接种量接种到装液量为150mL/500mL的发酵培养基中， 于30℃，150r/min发酵156h后结束。