[发明专利]细菌噬菌体基因组DNA提取试剂盒及方法

权利要求书

1.一种细菌噬菌体基因组DNA提取试剂盒，其特征在于，包括以下试剂：

(1)试剂A：氯仿；

(2)试剂B：用TE缓冲液配制的10-20mg/ml的DNase I；

(3)试剂C：用TE缓冲液配制的10-20mg/ml的RNase A；

(4)试剂D：含300-400mg/ml的聚乙二醇-8000和3M NaCl；

(5)试剂E：每升含有5.8g NaCl、1.23g MgSO₄·7H₂O、50ml的1M pH8.0的Tris-Cl和100ml 0.05mol EDTA；

(6)试剂F：150-200mg/ml的十二烷基苯磺酸钠；

(7)试剂G：用TE缓冲液配制的15-25mg/ml的蛋白酶K；

(8)试剂H：5-6M NaCl；

(9)试剂I：含6-7M异硫氰酸胍和100mM Tris，pH 6.4；

(10)试剂J：由5-10mM pH 8.0的Tris-Cl与无水乙醇按1:4的体积比混合而成；

(11)试剂K：5-10mM pH 8.0的Tris-Cl；

所述的TE缓冲液含有10mM三羟基甲基氨基四烷和1mM乙二酸四乙酸，pH 8.0；

所述的细菌噬菌体为溶藻弧菌噬菌体ФPE333、大肠杆菌噬菌体ФP1655或阴沟肠杆菌噬菌体ФPZJ02。

2.一种细菌噬菌体基因组DNA的提取方法，其特征在于，具体步骤如下：

(1)细菌菌体及其碎片去除：细菌过夜培养后，按体积分数2％接种于LB新鲜培养基，加入体积分数2％的噬菌体液，37℃振荡培养4-6小时，即获得细菌的噬菌体裂解物；取细菌的噬菌体裂解物10-20ml，加入试剂A使其终浓度为体积分数1％，4℃10000g离心10min；

(2)细菌核酸降解：小心取上清，用0.45μm滤膜过滤，取滤液向其中加入10-20μL试剂B及10-20μL试剂C，混匀，37℃温育30min；

(3)细菌噬菌体粒子沉淀：加入5-10ml试剂D，轻柔上下混合，冰上放置60min以上或4℃过夜放置；10000g，4℃离心10min，小心弃去上清，得细菌噬菌体粒子沉淀；

(4)细菌噬菌体衣壳蛋白结构破坏和水解：向细菌噬菌体粒子沉淀中依次加入250-500μL试剂E、50-100μL试剂F和1.5-3μL试剂G，50℃温育30min；

(5)杂质去除：加入100-200μL试剂H，轻柔混匀4-6次，12000g离心10min，取上清；

(6)DNA离液：加入步骤(5)所取上清二分之一体积的试剂I，上下轻轻颠倒混匀6-8次得混合液；

(7)DNA吸附：将DNA吸附柱放置在离心管中，将上述步骤(6)中的混合液移入DNA吸附柱，12000g离心1min，弃去过滤液；

(8)吸附DNA清洗：向DNA吸附柱中加入600-700μL试剂J，12000g离心1min，弃去过滤液；再次加入600-700μL试剂J，12000g离心1min，弃去过滤液，将DNA吸附柱室温放置2-5min；

(9)吸附DNA洗脱：将DNA吸附柱转移到一支新的离心管中，加入50-100μL试剂K于DNA吸附柱的膜中央，室温放置1-2min；12000g离心1min，取洗脱液即得到细菌噬菌体基因组DNA；所述的细菌噬菌体为溶藻弧菌噬菌体ФPE333、大肠杆菌噬菌体ФP1655或阴沟肠杆菌噬菌体ФPZJ02；

所述的试剂如下：

(1)试剂A：氯仿；

(2)试剂B：用TE缓冲液配制的10-20mg/ml的DNase I；

(3)试剂C：用TE缓冲液配制的10-20mg/ml的RNase A；

(4)试剂D：含300-400mg/ml的聚乙二醇-8000和3M NaCl；

(5)试剂E：每升含有5.8g NaCl、1.23g MgSO₄·7H₂O、50ml的1M pH8.0的Tris-Cl和100ml 0.05mol EDTA；

(6)试剂F：150-200mg/ml的十二烷基苯磺酸钠；

(7)试剂G：用TE缓冲液配制的15-25mg/ml的蛋白酶K；

(8)试剂H：5-6M NaCl；

(9)试剂I：含6-7M异硫氰酸胍和100mM Tris，pH 6.4；

(10)试剂J：由5-10mM pH 8.0的Tris-Cl与无水乙醇按1:4的体积比混合而成；

(11)试剂K：5-10mM pH 8.0的Tris-Cl；

所述的TE缓冲液含有10mM三羟基甲基氨基四烷和1mM乙二酸四乙酸，pH 8.0。