[发明专利]靶向肝星状细胞的siRNA脂质纳米囊泡及应用

说明书

技术领域

本发明涉及基因治疗和纳米靶向递送技术领域，是实现基因药物肝脏靶向递送并发挥治疗作用的有效方法。

背景技术

基因治疗是一种有效的治疗方法，可用于治疗多种严重威胁人类健康的疾病．然而，裸露的基因治疗药物存在易被核酶降解、细胞内吞效果差和细胞靶向能力差等缺点。选择合适的基因递送系统,使目的基因靶向,可控并有效地表达,是基因治疗成功的关键。

目前外源基因的递送系统主要有病毒递送系统和非病毒递送系统，其中非病毒递送系统以其安全性、低毒性、低免疫反应、靶向性及易于组装等优点被寄予厚望。非病毒递送系统的本质是将基因治疗中基因看作为药物,然后从药剂和药理学的角度将基因导入靶细胞或组织、器官并进行表达。非病毒基因递送系统以脂质体与阳离子聚合物使用较多。其中，脂质纳米囊泡递送系统是融合阳离子聚合物的正负电荷的吸引和脂质体的包裹优点而设计的智能靶向递送系统。

脂质纳米囊泡的传统制备方法是脂膜水化法，但该方法多用于小分子药物脂质体的制备。由于核酸药物的大尺寸和亲水性，核酸药物不易被包载入脂膜水化法制备的脂质体中。包载核酸药物或者基因药物脂质纳米囊泡的制备多用乙醇稀释法，即同时用油相（乙醇作油相溶剂）和水相同时融合的方法来制备。

发明内容

本发明的目的是提供一种靶向肝星状细胞的siRNA脂质纳米囊泡，该纳米囊泡作为基因药物的递送系统。

本发明的另一目的是提供一种靶向肝星状细胞的siRNA脂质纳米囊泡在制备治疗肝纤维化药物中的应用。

本发明的目的是这样实现的：

一种靶向肝星状细胞的siRNA脂质纳米囊泡，特点是该纳米囊泡包括治疗成分和递送成分，所述递送成份为具有肝星状细胞靶向性的磷脂多肽（PPB-DSPE-PEG）、阳离子脂质（DlinMC3)、PEG修饰的脂质（PEG-DMG）、磷脂（DSPC）及胆固醇，其摩尔比为1︰40︰1︰10︰48；治疗成份为抑制gp46基因高表达(基因高表达指的基因表达相对于正常表达较高)的siRNA；siRNA和阳离子脂质的摩尔比是7.6︰1；通过乙醇稀释法制备该纳米囊泡，将该纳米囊泡作为siRNA的递送系统；所述基因高表达指的基因表达相对于正常表达较高。

所述乙醇稀释法制备包括以下步骤：

1）配制溶液

ⅰ）siRNA水相溶液

配制200mM的柠檬酸溶液、2M的氢氧化钠溶液调至pH5，加入150mM的氯化钠，混合溶解后得水相溶液，水相溶液中加入siRNA溶解，即得到siRNA水相溶液，其中siRNA浓度约为10-40nmol/ml；

ⅱ）脂类油相溶液

按无水乙醇与超纯水的体积比为9︰1配制，摇匀得油相溶液，脂类溶质包括磷脂多肽（PPB-DSPE-PEG）、阳离子脂质（DlinMC3)、PEG修饰的脂质（PEG-DMG）、磷脂（DSPC）及胆固醇，将分别称量的脂类溶质溶解于同一个油相溶液中，使其溶解在油相溶液中的浓度分别为0.03nmol/ml,1.3nmol/ml,0.03nmol/ml,0.33nmol/ml,1.58nmol/ml,溶解后即得到脂类的油相溶液；

ⅲ）稀释液

配制200mM的柠檬酸溶液、2M的氢氧化钠溶液调至pH6，加入300mM的氯化钠，混合溶解得稀释液；

2）搭建制备装置

用两个T形三孔接头连接三个注射器和一个纳米囊泡接收器，构成制备装置；所述纳米囊泡接收器为10K截留分子量的超滤离心管；

3）靶向纳米囊泡的制备

将搭建好的制备装置置于37℃恒温条件下，三个注射器中分别吸入siRNA水相溶液、脂类油相溶液及稀释液，三个注射器同时挤出，脂类油相溶液中的脂类在此过程中自发形成油包水型的纳米囊泡结构；纳米囊泡接收器端接收制备出的纳米囊泡，并经10K截留分子量的超滤离心管以4000转/分钟的转速离心8-12分钟,除去乙醇、水相溶液、稀释液及未包载入囊泡的siRNA，截留管内的纳米囊泡；然后在超滤离心管内加入磷酸盐缓冲溶液，纳米囊泡稳定保存在磷酸盐缓冲溶液中；用移液器吸取转移到样品瓶中，通过微孔滤膜除菌，然后置于4℃冰箱保存；其中，所述siRNA水相溶液、脂类油相溶液及稀释液的体积比为1︰1︰2。

本发明的有益效果