[发明专利]一种预防天女木兰芽组培褐化的培养基配方及方法

说明书

技术领域

本发明属于组织培养领域，涉及一种预防天女木兰芽组培褐化的培养基配方及方法。

背景技术

天女木兰(Magnolia sieboldiiK. Koch)是木兰科(Magnoliaceae)木兰属(Magnolia)的落叶小乔木，国家三级濒危树种。天女木兰兼有观赏、芳香和药用价值,是一种很有开发前景的珍稀野生木本植物资源。

天女木兰芽组织培养过程中，外植体褐化现象经常发生。褐化严重影响外植体的脱分化和再分化，造成培养失败，这已成为天女木兰组织培养中的棘手问题，同时也成为天女木兰快繁体系建立的一大障碍,目前还没有令人满意、有效防止天女木兰组培褐化现象的方法。

天女木兰褐化产生的机理与许多木本植物相同，褐化主要是多酚氧化酶（PPO）作用于天然底物酚类物质引起的；PPO是植物体中普遍存在的一种末端氧化酶，正常情况下细胞内的酚类物质和PPO呈区域性分布，酚类物质分布在液泡中，PPO分布在质体和细胞质中且与膜结合呈潜伏状态；当外植体被切割时，膜结构瓦解，PPO受到活化与酚类物质接触，将酚氧化成醌类物质产生褐化现象。醌类物质在酪氨酸酶的作用下，与外植体中的蛋白质发生聚合，引起其他酶系统失活，导致代谢紊乱，生长受阻。根据现有文献人们进行天女木兰组织培养通常采用B5培养基，其原因是B5培养基相对MS等其它类型培养基褐化较轻（杜凤国2007年）。目前预防天女木兰芽组培褐化现象，主要采取以下二种方法。1、培养基中添加抗氧化剂，比如：维生素C和半胱氨酸等抗氧化剂，其作用是防止外植体释放的酚类物质被氧化，对酚类物质具有保护作用； 2、在培养基中加入吸附剂，比如：活性炭或聚乙烯比咯烷酮，其作用是把外植体体释放的酚类物质及氧化形成的醌类物质吸附，从而达到防止外植体褐化目的（王欢2012年）。尽管具有一定的预防褐化效果，但是对于不同月份取的芽进行组织培养，其防止褐化效果差异较大，结果还不能令人满意，至今还未有有效预防天女木兰芽组培褐化培养基的配方及方法。

发明内容

本发明目的针对天女木兰芽组培褐化严重问题，提出一种预防天女木兰芽组培褐化的培养基配方及方法。

本发明解决的技术问题采用如下技术方案：

在B5培养基中添加适量抗氧化剂(维生素C和谷胱甘肽)与多酚氧化酶抑制剂(苯甲酸钠),形成有效预防天女木兰芽组培褐化配方及方法。

配方分为无菌苗培养基（初代培养）、继代培养基和生根培养基配方。

一种天女木兰无菌苗培养基配方，其特征包括如下组分:在B₅培养基中添加细胞分裂素6－苄基腺嘌呤（以下简称6－BA）0.5mg/L 、生长素萘乙酸（以下简称NAA）0.3mg/L、维生素C（以下简称Vc）300～500mg/L、谷胱甘肽（以下简称GSH）100～150mg/L、苯甲酸钠30～50mg/L和蔗糖30g/L，调pH5.6-5.8。

继代培养基配方,其特征包括如下组分：在培养基B5中添加细胞分裂素噻苯隆（以下简称TDZ）0.3mg/L、NAA 0.3 mg/L、Vc300～500mg/L、GSH 100～150 mg/L、苯甲酸钠30～50 mg/L、蔗糖3g/L和琼脂7g/L，调pH5.6～ 5.8。

生根培养基配方，其特征包括如下组分：在1/2 B5培养基中添加NAA0.5mg/L、维生素C 300mg/L、GSH 50mg/L 、苯甲酸钠30mg/L、活性炭500 mg/L、蔗糖3g/L和琼脂7g/L，调pH5.6～ 5.8。

本发明的有益效果

（1）本方法采取添加抗氧化剂和多酚氧化酶抑制剂，从多条途代谢途径上预防天女木兰芽组培褐化现象。本配方预防褐化效果显著，褐化率小于10%，预防了天女木兰芽组培褐化率高的问题。

（2）培养基中添加两种抗氧化剂维生素C和谷胱甘肽，具有以下优点：抗氧化能力强，对外植体释放的酚类物质具有较强保护作用；对植物生长及自然环境没有毒副作用；水溶性好、使用方便。配方中同时添加两种抗氧化剂，其预防褐化效果优于使用单一抗氧化剂。

（3）培养基中添加适量多酚氧化酶抑制剂苯甲酸钠，具有抑制多酚氧化酶活性强、水溶性好、使用方便等优点，不但能抑制多酚氧化酶活性，还能起到一定程度杀菌作用，减少培养基的杂菌污染几率。

具体实施方式

实施例1