[发明专利]万寿菊细胞培养生产游离叶黄素的方法

权利要求书

1.万寿菊细胞培养生产游离叶黄素的方法，其特征在于按照下述步骤进行：

（1）将来自万寿菊植株的外植体清洗干净、灭菌，接种于愈伤组织诱导培养基上，诱导产生愈伤组织细胞；步骤（1）中所述的外植体为新鲜万寿菊花的花瓣；

（2）愈伤组织细胞在同样组成的培养基中连续传代增殖 培养，经筛选建立细胞形态均一、生长稳定的万寿菊愈伤组织细胞系；步骤（2）中所述的筛选具体是指，每次传代时选取收获细胞中30%～50%，形态疏松的、浅黄色愈伤组织细胞作为种子进行继代培养；筛选过程至少持续10代，直至所获得的细胞均为形态疏松的，颜色为浅黄色，生长稳定，建立愈伤组织细胞系；

（3）将步骤（2）筛选得到的万寿菊愈伤组织细胞系转入液体培养基中进行摇瓶悬浮培养，筛选并建立稳产、高产游离叶黄素的万寿菊悬浮细胞培养系；步骤（3）中所述的筛选具体是指，每次传代时选取收获细胞中30%～50%，分散性好、呈深绿色的细胞作为种子细胞进行继代培养，除去坚硬的细胞团以及呈褐色或者白色的细胞；筛选过程至少持续10代，直至所获得的细胞均为分散性好，形态为单细胞状态、非细胞团，颜色为深绿色，建立悬浮细胞培养系；

（4）将稳产、高产游离叶黄素的万寿菊悬浮细胞接种到同样组成的新鲜液体培养基中扩大培养，进行游离叶黄素的生产；

（5）培养细胞冷冻干燥后用有机溶剂浸提，然后测定游离叶黄素的产率。

2.权利要求1的方法，其特征在于：步骤（1）中所述的愈伤组织诱导培养基为MS（Murashige and Skoog，1962）基础培养基，添加终浓度0.1～5 mg/L 1-萘乙酸（1-Naphthaleneacetic acid），0.1～5 mg/L 6-苄氨基嘌呤（6-Benzylaminopurine），10～50g/L蔗糖和5～15 g琼脂；培养基pH值为5.4～6.2；愈伤组织诱导条件为，黑暗条件下诱导，温度为15～30℃。

3.权利要求1的方法，其特征在于：步骤（2）中所述的连续传代增殖 培养具体是指，接种密度为50～200 g/L；暗培养；温度为15～30℃；每2～4周继代培养一次。

4.权利要求1的方法，其特征在于：

步骤（3）中所述的悬浮细胞所用的培养基为MS（Murashige and Skoog，1962）基础培养基，添加终浓度0.1～5 mg/L 1-萘乙酸（1-Naphthaleneacetic acid），0.1～5 mg/L 激动素（kinetin），10～50 g/L蔗糖，pH值为5.4～6.2。

5.权利要求1的方法，其特征在于：步骤（3）中所述的悬浮细胞采用摇床旋转振荡培养，摇床转速为80～150 rpm；温度为20～30℃；光照培养；每隔7～21天继代培养一次；细胞接种量为50～200 g/L。

6.权利要求5的方法，其特征在于：步骤（3）中所述的悬浮细胞光照培养具体是指，光源组成为白光或者白光和蓝光的混合光，每天光照时间为4～24小时，总光照强度为2000～15000 Lux。

7.权利要求6的方法，其特征在于：步骤（4）中所述的悬浮细胞扩大培养是指，按照步骤（3）的方法大规模培养悬浮细胞。

8.权利要求1的方法，其特征在于：步骤（5）中所述的有机溶剂浸提过程为：室温下，将冷冻干燥后的细胞粉碎成粉末状，然后用中等极性或者非极性有机溶剂提取，固液分离，收集提取液；固体再次用有机溶剂提取，共提取2～5次；合并提取液，过滤，减压蒸干；

每次提取过程中，细胞粉末与有机溶剂质量体积比例1 g：5～25 ml；每次提取时，先超声提取10～60分钟，然后振荡或者静置提取30分钟～3小时；

步骤（5）中所述的中等极性或者非极性有机溶剂包括甲醇、乙醇、丙酮、石油醚、乙醚、三氯甲烷、二氯甲烷或乙酸乙酯中的一种或二种以上；

步骤（5）中所述的测定游离叶黄素的产率具体是指，用色谱纯甲醇溶解步骤（5）获得的提取物，然后用超高效液相色谱测定游离叶黄素的产率，分析方法如下：

色谱柱：Waters ACQUITY UPLC^® BEH C₁₈色谱柱（50 mm × 2.1 mm，1.7 μm）；流动相：A为乙腈-甲醇（90 : 10，v/v），B为纯水；等度洗脱程序：0 ~ 2.5 min，90%A；2.5 ~ 3.0 min，90% A ~ 100% A；3.0 ~ 6.0 min，100% A；6.0 ~ 6.5 min，100% A ~ 90% A；6.5 ~ 9.5min，90% A；柱温：25 ℃；流速：0.4 mL/min；进样体积：5 μL；检测波长：448 nm。