[发明专利]测定肝微粒体中虫草素代谢物的液质联用方法

权利要求书

1.测定肝微粒体中虫草素代谢物的液质联用方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)虫草素肝微粒体的温孵培养

在培养瓶中加入肝微粒体、NADP、NADH、G-6-P、G-6-P DH以及MgCl₂后，补加三(羟甲基)氨基甲烷盐酸缓冲液配成肝微粒体孵育体系；在37℃全温振荡器温孵2-5min，再定量加入虫草素的三(羟甲基)氨基甲烷盐酸缓冲液，开始反应，30min后将培养瓶从全温振荡器中取出，迅速加入冷的有机溶剂A终止代谢反应，得温孵产物；

2)样品处理

将温孵产物涡旋振荡30s，5000r/min离心10min，准确吸取上清液，在氮气下吹干后得残留物；残留物用甲醇复溶，涡旋振荡后，5000r/min离心10min，吸取上清液，上清液过0.22μm微孔滤膜后，进样10μL，进行液质检测；

3)样品分析

进行肝微粒体中虫草素代谢物测定，具体条件如下：

色谱条件：

色谱柱：Diamonsil^TM ODS C₁₈；流动相：甲醇:水＝15:85；洗脱时间：t＝32min；进样量：10μL；检测波长：λ＝260nm；柱温：30℃；流速：0.5mL/min；

质谱条件：

一级质谱：电离模式：电喷雾电离(ESI)；扫描模式：正离子扫描；电喷雾电压：4.0bar；干燥气流速：10L/min；干燥气温度：200℃；

二级质谱：电离模式：电喷雾电离(ESI)；扫描模式：正离子扫描；碰撞气：氮气；毛细管电压：2.8kV；锥孔电压：3.0V；源温度：110℃；脱溶剂温度：350℃；脱溶剂气体流量：10L/min；碰撞能量：15-25eV。

2.根据权利要求1所述的测定肝微粒体中虫草素代谢物的液质联用方法，其特征在于：所述步骤1)有机溶剂A为甲醇或乙腈，其加入量体积为反应体系的2-4倍。

3.根据权利要求1所述的测定肝微粒体中虫草素代谢物的液质联用方法，其特征在于：所述步骤3)中色谱柱型号为Diamonsil^TM ODS C₁₈，色谱柱250mm×4.6mm，5μm。

4.根据权利要求1所述的测定肝微粒体中虫草素代谢物的液质联用方法，其特征在于：步骤1)中三(羟甲基)氨基甲烷盐酸缓冲液的pH为7.4。

5.根据权利要求1所述的测定肝微粒体中虫草素代谢物的液质联用方法，其特征在于：步骤1)孵育体系中肝微粒体的浓度范围为2.0-4.0mg/mL、NADP的浓度范围为0.5-1.0mmol/L、NADH的浓度范围为0.5-1.0mmol/L、G-6-P浓度为10mmol/L、G-6-P DH的浓度范围为1.0-2.0IU/mL、MgCl₂的浓度为4.0mmol/L、虫草素的浓度范围为1.0-1.5mg/10mL。

6.根据权利要求1所述的测定肝微粒体中虫草素代谢物的液质联用方法，其特征在于：所述肝微粒体为小鼠、大鼠或人的肝微粒体。

7.根据权利要求1所述的测定肝微粒体中虫草素代谢物的液质联用方法，其特征在于：步骤1)中三(羟甲基)氨基甲烷盐酸缓冲液的浓度是50mmol/L。