[发明专利]一种永生化的犬脂肪间充质干细胞系及其构建方法

权利要求书

1.一种永生化的犬脂肪间充质干细胞系，其特征在于，是以犬脂肪间充 质干细胞作为宿主细胞，利用携带SV40大T抗原基因序列的慢病毒载体， 将Tag基因整合入犬脂肪间充质干细胞基因组中，经过连续传代筛选得到表 达SV40大T抗原且具有多向分化潜能的细胞系。

2.如权利要求1所述的永生化的犬脂肪间充质干细胞系，其特征在于， 其细胞为成纤维样，呈多角形和短梭状，有两个或两个以上的核仁，细胞间 存在接触抑制。

3.如权利要求1所述的永生化的犬脂肪间充质干细胞系，其特征在于， 永生化的犬脂肪间充质干细胞系在传代培养50代以后SV40大T抗原还能够 被表达。

4.如权利要求1所述的永生化的犬脂肪间充质干细胞系，其特征在于， 是通过pLOX-Ttag-iresTK表达载体对Tag基因进行携带，将Tag基因整合入 犬脂肪间充质干细胞基因组。

5.如权利要求4所述的永生化的犬脂肪间充质干细胞系，其特征在于， 所述的pLOX-Ttag-iresTK表达载体是与包装质粒pLP/PsPAX、pLP/VSVG构 成慢病毒转染载体。

6.如权利要求1所述的永生化的犬脂肪间充质干细胞系，其特征在于， 所述的多向分化潜能包括向三胚层细胞分化的潜能、向成骨细胞分化的潜能、 向软骨细胞分化的潜能。

7.一种永生化的犬脂肪间充质干细胞系的构建方法，其特征在于，包括 以下步骤：

1)犬脂肪间充质干细胞的传代培养：将无菌采集的犬腹腔脂肪去杂后切 碎，利用Ⅰ型胶原酶于37℃震荡充分消化；然后加入培养液终止消化后离心； 弃去上层悬液及上浮的白色脂肪，加入培养液吹打均匀，200目筛网过滤， 滤液离心后弃去上清，培养液重悬细胞，置于37℃、5％CO₂的培养箱中培养； 待细胞生长至90％融合时，以胰蛋白酶消化，以1:3比例传代，每两天换液 一次；

所述的培养液为：α-MEM培养基中加入10％体积分数的FBS、2mol/L 的谷氨酰胺和100mg/mL的青霉素/链霉素；

2)包装携带SV40大T抗原基因的慢病毒：取293T细胞接种于10％FBS 无抗性DMEM培养液中，37℃、5％CO₂培养箱中培养24h，然后将转染复 合物逐滴加入；培养16h后，换入含有10％体积分数的FBS、0.01mol/L胆 固醇、0.01mol/L蛋黄卵磷脂和chemicallydefinedlipidconcentrate的 AdvancedDMEM病毒包装液，继续培养48h后，收集细胞上清，得到慢病 毒上清液；

所述的转染复合物为：将包装质粒pLP/PsPAX、pLP/VSVG和质粒 pLOX-Ttag-iresTK混合后加入Opti-MEM培养液中，然后加入转染试剂 Turbofect，混匀放置；

3)待传代的犬脂肪间充质干细胞融合度达到50％，将收集到的慢病毒 上清液与α-MEM培养液按1:1的体积比例换入犬脂肪间充质干细胞；转染 8h后，换入3mLα-MEM培养液；待细胞单层铺满整个培养皿后传代培养， 在37℃、5％CO₂条件连续传代培养超过50代后，得到稳定转染Ttag基因 的犬脂肪间充质干细胞。

8.如权利要求7所述的永生化的犬脂肪间充质干细胞系的构建方法，其 特征在于，具体包括以下操作：

1)犬脂肪间充质干细胞的传代培养：将无菌采集的犬腹腔脂肪，置于预 冷的PBS中冲洗并除去血液、筋膜后剪成碎组织块，加入Ⅰ型胶原酶，于 37℃震荡消化1h；加入培养液终止消化后1000rpm，离心5min；弃去上层 悬液及上浮的白色脂肪，加入培养液吹打均匀，200目筛网过滤，滤液1000 rpm，5min常温离心；弃去离心后的上清，培养液重悬细胞并计算细胞活力； 按每孔2×10⁵个细胞接种于12孔板，置于37℃、5％CO₂的培养箱中培养； 待细胞生长至90％融合时，以0.25％质量分数的胰蛋白酶消化，以1:3比例 传代，每两天换液一次；

2)包装携带SV40大T抗原基因的慢病毒：取293T细胞以1×10⁶个/mL 的密度接种于10％FBS无抗性DMEM培养液的60mm培养皿中，37℃、5％ CO₂培养箱中培养24h，当细胞密度达60％时，将包装质粒pLP/PsPAX2.6 μg、pLP/VSVG1.8μg和质粒pLOX-Ttag-iresTK1.6μg加入600μL Opti-MEM培养液中，后加入6μL转染试剂Turbofect，混匀放置20min； 将转染复合物逐滴加入培养皿；培养16h后，换入含有10％体积分数的FBS、 0.01mol/L胆固醇、0.01mol/L蛋黄卵磷脂和1×chemicallydefinedlipid concentrate的AdvancedDMEM病毒包装液，继续培养48h后，收集细胞上 清，于-80℃保存；

3)待犬脂肪间充质干细胞融合度达到50％，将收集到的慢病毒上清液 与α-MEM培养液按1:1的体积比例换入犬脂肪间充质干细胞进行转染；转 染8h后，换入α-MEM培养液；待细胞单层铺满整个培养皿后传代培养，在 37℃、5％CO₂条件连续传代培养超过50代后，得到稳定转染Ttag基因犬脂 肪间充质干细胞。