[发明专利]固定化酶法制备三磷酸腺苷的方法有效

专利信息
申请号: 201610165471.7 申请日: 2016-03-22
公开(公告)号: CN105647996B 公开(公告)日: 2019-02-19
发明(设计)人: 于铁妹;刘珊珊;黄庆军;秦永发 申请(专利权)人: 深圳市古特新生生物科技有限公司
主分类号: C12P19/32 分类号: C12P19/32;C12N11/08;C12N11/12;C12N11/10
代理公司: 北京彭丽芳知识产权代理有限公司 11407 代理人: 彭丽芳
地址: 518103 广东省深圳市*** 国省代码: 广东;44
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摘要:
搜索关键词: 固定 法制 磷酸 腺苷 方法
【说明书】:

发明公开了一种固定化酶法制备三磷酸腺苷的方法,包括以下步骤:(1)将ATP生产酶固定于固定化载体上,制备固定化ATP生产酶;(2)利用固定化ATP生产酶,催化制备三磷酸腺苷反应液;以及(3)分离产物三磷酸腺苷(ATP)。本发明采用新型Ppk、Adk、Pap三种ATP生产酶,只需两步酶促反应即可合成ATP,反应过程更简单,反应更容易控制,产品质量更加稳定;采用固定化酶催化的方法制备ATP,固定化酶可连续、反复多次使用,大幅的降低了生产成本。同时避免了使用酵母引入的大量蛋白、色素等杂质,更加易于纯化;建立了适用于大规模生产ATP的间歇搅拌反应及酶反应柱连续反应体系。

技术领域

本发明涉及三磷酸腺苷的制备方法,特别涉及一种固定化酶法制备三磷酸腺苷的方法。

背景技术

三磷酸腺苷(ATP)是一种由一个腺嘌呤,一个核糖和三个磷酸基团组成的高能化合物,分子式C10H16N5O13P3,分子量为507。它是生物体内的能量转换器和贮存器,在人体能量代谢中起着重要的作用,作为代谢的中间体、辅酶参与生物体内脂肪、蛋白质、糖类和核酸等的代谢。在临床应用上,ATP已作为治疗试剂,对进行性肌肉萎缩、中风后遗症、心肌梗塞、心肌炎、冠状动脉硬化、肝炎等病症具有良好的治疗和辅助治疗作用。近年来国外学者结合ATP和腺苷(Ado)、环化腺苷酸(cAMP)的构效关系,及其受体的生理作用,认为ATP在防治肿瘤,调节神经等方面具有明显作用。因此,ATP的生物体外合成研究和临床应用实验,无论在生理医学还是工业应用上都具有重要意义。

ATP的合成主要有化学合成法、酶催化合成、光合磷酸化和氧化磷酸化、微生物酶系催化合成等方法。利用酵母菌的糖酵解途径,以腺苷Ado或腺苷酸(AMP)为底物,进行基质水平磷酸化合成ATP是最常用的方法,也是目前工业化生产ATP普遍采用的方法。然而,经酵母细胞酶系催化合成ATP的反应过程复杂,参与催化反应的酶系众多,反应过程不易控制,产品批次间质量差异较大。同时酵母酶系质量常因供应的厂家不同、批次不同、甚至季节不同而有很大差异。酵母细酶系质量不稳定,酶活力下降快,使用寿命短,一般是一次性使用。反应过程需要加入大量的酵母细胞酶液,引入了大量的蛋白、色素等杂质给后期纯化带来了很大的困难。目前,我国ATP生产水平总体还比较低,产品的产量、成本控制、产品质量等方面还有所欠缺。面对以上的技术问题,急需开发新型稳定的反应工艺,简化反应过程提高产品的质量。

研究表明,在某些细菌体内存在着依赖于多聚磷酸盐的酶系,可利用ADP或AMP生成ATP。该酶系包含多聚磷酸激酶(EC 2.7.4.1,Ppk)、AMP激酶 (EC 2.7.4.3,Adk)、多聚磷酸-AMP磷酸转移酶(EC 2.7.4.-,Pap),本发明中统称三种酶为“ATP生产酶”。其中,Ppk催化ADP与聚磷酸盐类化合物反应生成ATP,Adk催化2分子ADP生成1分子ATP和1分子AMP,Pap则催化AMP与聚磷酸盐类化合物反应生成ADP,三种酶的合理组合均可用于合成ATP(参见图1)。为解决酵母酶系生产ATP存在的一系列问题,本发明利用ATP生产酶制备ATP,生产工艺更简单。在实际应用中酶的成本昂贵,利用游离酶生产ATP,酶活下降迅速,无法有效的回收利用,势必会导致生产成本过高,影响了实际应用价值。本发明将ATP生产酶固定化,可实现酶的重复和连续利用,大大降低了生产成本,同时固定化酶的使用,产物更容易纯化产品质量更加稳定。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种固定化酶法制备三磷酸腺苷的方法,从而克服现有技术的上述缺陷。

本发明所要解决的技术问题是通过以下技术方案来实现的:

一种固定化酶制备三磷酸腺苷的方法,包括以下步骤:

(1)制备固定化ATP生产酶:

将ATP生产酶固定于固定化载体上,制得固定化ATP生产酶。

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