[发明专利]一种分离纯化大豆蛋白酶抑制因子的方法

权利要求书

1.一种分离纯化大豆蛋白酶抑制因子的方法，其特征在于，将脱脂大豆粉，先后经粗提取、凝胶柱预纯化和分子筛色谱分离纯化得到大豆蛋白酶抑制因子；其中，所述粗提取为将脱脂大豆粉与20mM pH6.4 Bis-Tris-HCl缓冲液按照1g：20～40mL的比例混合，室温提取2～3h，然后在3～8℃的条件下离心收集上清液，得到样品提取液；所述大豆蛋白酶抑制因子为Kunitz型胰蛋白酶抑制因子。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述粗提取为将脱脂大豆粉与20mM pH6.4Bis-Tris-HCl缓冲液按照1g：30mL的比例混合，室温提取2h，然后在4℃的条件下离心收集上清液，得到样品提取液。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，将脱脂大豆粉与20mM pH6.4 Bis-Tris-HCl缓冲液按照1g：30mL的比例混合，1200rpm室温提取2h，然后在12000rpm，4℃的条件下离心20min后，收集上清液，得到样品提取液。

4.根据权利要求1～3任一项所述的方法，其特征在于，所述脱脂大豆粉的制备方法为：将生大豆粉碎为60目粒度的生大豆粉，将生大豆粉与正己烷按照1g：30mL的比例混合，置于涡旋混合仪上，1200rpm室温提取1h，然后在12000rpm，室温条件下离心15min后，弃掉上清液，置于通风橱中，将残存正己烷挥发干净后即得脱脂大豆粉。

5.根据权利要求1～3任一项所述的方法，其特征在于，所述凝胶柱预纯化为：将所述样品提取液经过0.2μm滤膜过滤后注入经20mM pH6.4的Bis-Tris-HCl缓冲液平衡后的弱阴离子交换柱，流动相由缓冲液A相和缓冲液B相两相组成：缓冲液A相为20mM pH6.4的Bis-Tris-HCl缓冲液，缓冲液B相为含1M NaCl的20mM pH6.4的Bis-Tris-HCl缓冲液，洗脱梯度程序如下：

收集第5.1-9.0min的280nm紫外吸收值不小于5mAU的目标蛋白洗脱液。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述分子筛色谱分离纯化为：将所述目标蛋白洗脱液通过高效液相色谱仪进行分子筛柱子的分离纯化，液相色谱条件为：色谱柱：Waters BEH SEC柱7.8×300mm 3.5μm；流动相为50mM pH7.5的磷酸盐缓冲液；所述磷酸盐缓冲液的流速为0.5mL/min，收集第18.8-19.2min的洗脱液得到纯化的大豆蛋白酶抑制因子。

7.根据权利要求1-3任意一项所述的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

S1、粗提取：

将50mg脱脂大豆粉与1.5mL 20mM pH6.4 Bis-Tris-HCl缓冲液混合，置于涡旋混合仪上，1200rpm室温提取1h，然后在12000rpm，4℃的条件下离心20min后，收集上清液，得到样品提取液；

S2、凝胶柱预纯化：

S21、将弱阴离子交换柱DEAE Fast Flow安装在蛋白纯化仪上，随后用20mM pH6.4的Bis-Tris-HCl缓冲液平衡10个柱体积；

S22、将S1所得的样品提取液经过0.2μm滤膜过滤后，取1mL样品提取液注入蛋白纯化仪，流动相由A、B两相组成：缓冲液A相为20mM pH6.4的Bis-Tris-HCl缓冲液，缓冲液B相为20mM pH6.4的Bis-Tris-HCl缓冲液含1M NaCl，洗脱梯度程序如下：

收集第5.1-9.0min的280nm紫外吸收值不小于5mAU的目标蛋白洗脱液；

S3、分子筛色谱分离纯化：

将S22收集到的目标蛋白洗脱液，装入进样小瓶，通过高效液相色谱仪进行分子筛柱子的分离纯化，液相色谱条件为：色谱柱：Waters BEH SEC柱7.8×300mm3.5μm；进样量：20μL；流动相为磷酸盐缓冲液：50mM pH7.5 PB缓冲液；所述磷酸盐缓冲液的流速为0.5mL/min，收集第18.8-19.2min的洗脱液得到纯化的大豆蛋白酶抑制因子。