[发明专利]一种高效表达碱性果胶酶的菌株及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种高效表达碱性果胶酶的菌株及其应用，属于基因工程技术领域。

背景技术

果胶酶是一种复合酶，能够将果胶聚合物分解成不饱和寡聚半乳糖醛酸。该酶分布广泛，在部分寄生线虫、植物和微生物内都有发现。果胶酶应用广泛，已有40多年的工业应用史。根据最适反应pH的不同将果胶酶分为酸性果胶酶和碱性果胶酶PGL。其中酸性果胶酶主要应用于澄清果汁果酒，提取果蔬汁，果实脱皮等方面。PGL应用主要应用于纺织、食品、造纸行业和环境领域。应用酶法作用上述领域相关反应具有环保、节约原料耗材和反应条件温和等优点。然而目前对PGL进行分子改造研究较少，进行商品化的PGL也很少。

目前表达碱性果胶酶的宿主主要是毕赤酵母、枯草芽孢杆菌和大肠杆菌。虽然通过发酵优化等手段可以有效提高碱性果胶酶的产量，但当达到一定限度碱性果胶酶的产量不能进一步提高，限制了碱性果胶酶的工业化生产，因此需从源头解决限制碱性果胶酶表达的因素。

毕赤酵母宿主虽然具有表达蛋白易于纯化等优点，然而目前的碱性果胶酶在毕赤酵母中表达时，存在表达量不高或者是外源基因原始核苷酸序列并不十分适合于毕赤酵母宿主的问题，从而限制了碱性果胶酶在毕赤酵母中的高效表达。

因此，有必要进一步提高碱性果胶酶生产菌株的生产能力以更适应工业化的需要。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了一种优化的碱性果胶酶，以及表达该碱性果胶酶的毕赤酵母基因工程菌。

所述碱性果胶酶基因核苷酸序列如SEQIDNO.1所示的序列。

所述毕赤酵母基因工程菌，是将核苷酸序列如SEQIDNO.1所示的碱性果胶酶基因连接到表达载体pPIC9K上，然后转化到毕赤酵母宿主菌株中得到的。

在本发明的一种实施方式中，所述表达载体为pPIC9K。

在本发明的一种实施方式中，所述毕赤酵母宿主为PichiapastorisGS115。

本发明还提供一种所述毕赤酵母基因工程菌的构建方法，步骤如下：

(1)采用化学全合成密码子优化后的碱性果胶酶基因PGL；

(2)将步骤(1)获得的碱性果胶酶基因连接到毕赤酵母表达载体pPIC9K上，得到重组质粒pPIC9K-PGL；

(3)将步骤(2)获得的重组质粒pPIC9K-PGL转化PichiapastorisGS115得到密码子优化的表达碱性果胶酶的基因工程菌株。

本发明还提供一种利用所述基因工程菌发酵生产碱性果胶酶的方法，是将基因工程菌活化后接种至生长培养基BMGY中于30℃、220rpm条件下培养24h，然后再转接入诱导培养基BMMY中，于23℃、220rpm条件下摇瓶发酵，诱导碱性果胶酶的表达。

在本发明的一种实施方式中，所述活化是接种于种子培养基YPD中培养14h；再以5％的接种量转入生长培养基BMGY。

在本发明的一种实施方式中，所述诱导的过程中每24h添加1.5％(v/v)的甲醇。

本发明还要求保护所述基因工程菌在食品、纺织或造纸方面的应用。

本发明的有益效果：

相对于基因优化前的原有基因工程菌株而言，本发明的基因工程菌株PichiapastorisGS115-pPIC9K-PGL酶活提高了25％，在摇瓶水平上的酶活可达到301.9U/ml(72h)，是现有报道的毕赤酵母中的最高水平，更高的酶活可以通过发酵罐上罐发酵和培养基优化来实现，为碱性果胶酶的大规模生产奠定了良好的基础。本发明得到的碱性果胶酶可在碱性条件下催化通过反式消去作用聚半乳糖醛酸的α-1,4糖苷键裂解，广泛应用于食品、纺织和造纸等行业。

说明书附图

图1：克隆表达质粒图谱；

图2：碱性果胶酶SDS-PAGE分析；1-3泳道分别代表GS115-pPIC9K、GS115-pPIC9K-PGL优化后、GS115-pPIC9K-PGL优化前；

图3：碱性果胶酶基因优化前后菌株发酵生产的碱性果胶酶的性能对比。

具体实施方式：

培养基：

种子培养基YPD(1L)：胰蛋白胨20g、酵母粉10g、葡萄糖20g。

生长培养基BMGY(1L)：蛋白胨20g，酵母粉10g，甘油40g，YNB13.4g，pH6.0的0.1M的磷酸盐缓冲液。