[发明专利]一种冻存口腔干细胞可用性筛检的方法

说明书

技术领域

本发明涉及干细胞技术领域，尤其是涉及一种可有效提升干细胞健康使用概率的冻存口腔干细胞可用性筛检的方法。

背景技术

干细胞是一类具有自我复制能力的多潜能细胞，具有增殖和分化潜能、以及自我更新复制的能力，能够产生高度分化的功能细胞。近年来，干细胞在美容整形、器官移植、疾病治疗、生物修复等领域开始得到快速应用和发展。口腔干细胞是继造血干细胞、脐带干细胞、脂肪干细胞之后有一个功能强大、应用领域广泛的干细胞类型。

为了进一步提高口腔干细胞的应用安全及潜能发挥等性能，本案发明人提出了一种冻存口腔干细胞可用性筛检的方法，以便将干细胞在冻存解冻复苏后所存在的基因先天缺陷、染色体损伤等缺陷及时筛检出来，进而确保干细胞在使用过程中的潜能健康发挥。

发明内容

本发明的目的在于提供一种冻存口腔干细胞可用性筛检的方法，为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种冻存口腔干细胞可用性筛检的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

步骤S001、操作人员将手洗净并用消毒水消毒，或者戴上消毒处理后的手套；

步骤S002、自液氮或干冰容器中取出洁净的培养容器，并将由干细胞无血清基础培养基、小分子肽、及螺旋藻混合所组成的新鲜培养基倒入该培养容器内；

步骤S003、将装有上述步骤S002中所述新鲜培养基的所述培养容器快速置于37℃恒温水槽中进行回温；

步骤S004、将上述步骤S003中回温后的所述培养容器用酒精含量达65％以上的酒精棉擦拭，擦拭后移入无菌操作台内待用；

步骤S005、将冻存有口腔干细胞的冷冻保存管取出，并立即放入37℃恒温水槽中快速解冻，且轻摇所述冷冻保存管使其内部的干细胞在1分钟内全部融化；

步骤S006、将经上述步骤S005中解冻后的干细胞悬浮液加入含有上述步骤S002中所述新鲜培养基的离心管内，以1000rpm的转速离心不低于3 分钟，然后去除以DMSO或glycerol冷冻保护剂为主要成份的上清液；

步骤S007、将经上述步骤S006离心去除冷冻保护剂后的干细胞液缓缓加入经上述步骤S004处理后的所述培养容器内，并将干细胞液与所述新鲜培养基按照1:5～1:10的稀释比进行均匀混合；

步骤S008、将上述步骤S007中装有稀释混合后干细胞液的所述培养容器放入培养箱中，对干细胞进行10小时以上的恢复性培养孵育；

步骤S009、用洁净试管取出经过上述步骤S008培养孵育后的干细胞10μl，并将10μl台盼蓝活性染料缓缓加入所述洁净试管内与10μl干细胞形成等比混合，轻轻摇晃所述洁净试管使混合充分；

步骤S010、将上述步骤S009中干细胞与台盼蓝活性染料的混合溶液缓缓倒入洁净的血球计数盘，盖上玻片，用100倍显微镜观察干细胞存活情况，没有被台盼蓝活性染料染色的干细胞为活细胞，被台盼蓝活性染料染成蓝色或红色的干细胞为死细胞；

步骤S011、借助上述步骤S010中的显微镜，用吸附器具将上述步骤S010中所发现的死细胞吸出，实现初步筛选；

步骤S012、利用染色质免疫共沉淀基因测序分析技术，对经过上述步骤S011初步筛选后的活干细胞，进行PGS与PGD全基因筛查诊断，以筛检干细胞的健康程度进而判断可用性。

其中，

所述步骤S002中的所述小分子肽是由2～4个氨基酸所组成的活性小分子肽；

所述新鲜培养基中干细胞无血清基础培养基、小分子肽、以及螺旋藻三者的组份比为9:0.35:0.65。

所述步骤S012还包括以下分步骤：

分步骤S01：利用植入前遗传学筛查PGS对干细胞的染色体数目和染色体结构进行检测，通过所述步骤S012中的染色质免疫共沉淀基因测序分析技术，分析检测干细胞的染色体是否存在数目和结构上的缺陷、以及是否存在遗传物质现象；

分步骤S02：利用植入前基因诊断PGD对干细胞中是否携带病变基因和遗传缺陷基因进行检测，通过所述步骤S012中的染色质免疫共沉淀基因测序分析技术，分析检测干细胞的基因病变几率。

本发明的有益效果是，通过将解冻后的干细胞放入带有小分子肽成份的新鲜培养基中进行恢复性培养孵育，极大限度上提高了干细胞的复苏率；然后通过台盼蓝活性染料将一部分已经死亡的干细胞进行初步筛选；最好再利用染色质免疫共沉淀基因测序分析技术，对干细胞进行PGS与PGD全基因筛查诊断，以得到干细胞的健康程度进而判断其可用性。

附图说明