[发明专利]牙周膜和牙龈干细胞实现肌腱组织再生的方法

说明书

技术领域

本发明涉及干细胞技术领域，尤其是涉及一种装载TGF-β3、RGD修饰的并载入了牙周膜干细胞和牙龈间充质干细胞的海藻酸盐微球共载体系的牙周膜和牙龈干细胞实现肌腱组织再生的方法。

背景技术

肌腱损伤可引起患者长期疼痛、不适和功能障碍。其有限的自我修复能力使得用再生治疗方法来功能性修复肌腱损伤显得尤为必要。间充质干细胞的应用可能为肌腱再生和修复提供新的治疗选择。

因为取材方便，在牙源性间充质干细胞中的牙周膜干细胞和牙龈间充质干细胞引来广泛关注，其可从口腔临床中废弃的生理组织中提取。该牙源性干细胞已经通过体内外的实验证明了其多向分化的能力。另外，因为牙周韧带含有肌腱样的胶原束，可以承受口腔咬合力，在肌腱再生治疗中，牙周膜干细胞表现出作为种子干细胞独特的潜力。

研究表明TGF-β通路在肌腱再生中起着很重要的作用。TGF-β3由于它是一个与促进皮肤伤口和肌腱愈合无纤维疤痕形成有关的同种型。由TGF-β3引导的间充质干细胞分化，能促进肌腱组织形成。为了修饰微环境特性和引导细胞向特定表型分化，将海藻酸凝胶和RGD相结合。海藻酸盐能提供一种利于MSCs的空间分布的三维支架，从而能得到一种类似于体内微环境的结构组织。

最近，本研究团队通过体内外实验发现，结合RGD的海藻酸凝胶可用于复合PDLSCs和GMSCs用作软骨再生，开发了一个能给牙源性MSCs(PDLSCs和GMSCs)的复合提供三维架构的共载体系。假设装有TGF-β3，复合PDLSCs 和GMSCs的RGD修饰的海藻酸水凝胶微球具有肌腱再生能力，对肌腱组织工程是一项有前景的应用。

发明内容

本发明的目的在于提供一种牙周膜和牙龈干细胞实现肌腱组织再生的方法，为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种牙周膜和牙龈干细胞实现肌腱组织再生的方法，其特征在于：该方法包括以下步骤：

步骤a.祖细胞分离和培养

选择并收集18-25岁因需拔牙的健康患者第三周磨牙的牙龈组织和牙齿，要求无任何牙周病史，送至实验室；

步骤b.生物材料制备

选取RGD-coupled海藻酸盐作为支架材料，对其进行处理以提高降解性，并与TGF-β3混合。

步骤c.细胞复合

将上述混合有TGF-β3配体的海藻酸盐中复合牙源性干细胞，将其添加到CaCl2溶液中以形成微球。

所述步骤b中还包括以下分步骤：

分步骤1，选取RGD-coupled的海藻酸盐，对其进行纯化和部分氧化(2％)，以增加其降解性；

分步骤2，收集该海藻酸盐、对其进行减压、冷冻及干燥处理；

分步骤3，将上述经过处理后的海藻酸盐与TFG-β3进行混合。

所述步骤c中还包括以下分步骤：

分步骤1，将步骤b中所得到的含有TGF-β3的RGD-coupled海藻酸盐溶液分别与PDLSCs、GMSC两种细胞以2*10⁶cells/mL的比例混合；

分步骤2，逐滴将上述混合物(MSC-混合物)添加到100mMCaCl₂的溶液中行成微球；

分步骤3，将上述微球在37℃环境中孵育45分钟以完成交联；

分步骤4，用不完全的DMEM清洗上述微球，清洗三遍。

本发明所提供的方法有益效果是：通过含有TGF-β3配体的RGD三肽耦合海藻酸盐微球作为牙源性MSC的复合载体，改善了牙源性细胞分化成肌腱样组织的微环境，为肌腱组织工程提供了一个独特的3d细胞交架。GMSCs很容易从口腔中获取，或者从废弃组织中提取，这些MSC源可以被认为是理想的干细胞库来源，在基于MSC的组织再生中很有潜力，该方法对于优化肌腱再生以及四肢骨骼修复等方面都有潜在应用前景。

附图说明

图1是本发明的步骤流程示意图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例：参照图所示，本发明所提供的一种牙周膜和牙龈干细胞实现肌腱组织再生的方法包括以下步骤：

步骤1.祖细胞分离和培养