[发明专利]CaHV-TNFR特异基因及应用

说明书

本发明公开了CaHV‑TNFR特异基因及应用，所述的CaHV‑TNFR特异基因序列为SEQ ID NO.1所示。针对该基因设计了用于鲫鳃出血症引物：CaHV‑MCP F/R、CaHV‑TNFR F/R。用这两对引物进行复合PCR扩增，当同时扩增到436bp和915bp两个片段时，可诊断为被CaHV感染；当仅扩增到436bp一个片段时，可检测为被CyHVs感染。本发明提供的基因序列和引物特别适合对急性鲫鳃出血症疱疹病毒病的基因诊断和分子流行病学调查，还适用于对水产动物疱疹病毒的监测预警，阳性检出率与准确率均超过98%，待检样品中含CaHV基因量为10pg/μL就可检出。

技术领域

本发明属于病毒学、渔业生物技术及水产动物医学领域，更具体涉及一种CaHV-TNF R特异基因，同时还涉及一种CaHV-TNFR特异基因的用途。

背景技术

世界动物卫生组织(OIE)已将鱼类疱疹病毒列为重点水生动物疫病名录，我国也已将其列入二类疫病名录[农业部渔业渔政管理局.2014年中国水生动物卫生状况报告.中国农业出版社,北京,2015]。疱疹病毒是一类有囊膜、含双链线性大DNA基因组的病毒。已知鲤疱疹病毒属(Cyprinivirus)是鱼蛙疱疹病毒科(Alloherpesviridae)的成员，称为鲤疱疹病毒组(C yprinid herpesviruseses)，含1型,2型和3型(CyHV1,CyHV2和CyHV3)[张奇亚,桂建芳.中国科学:生命科学,2014,44:1236–1252]，可缩写为CyHVs。疱疹病毒可感染养殖及野生鱼群，引起大规模死亡[Hanson et al,Viruses.2011,3(11):2160–2191；Lovy&Friend.Dis Aquat Org,2014,108:1–9]。

鲫(Carassius auratus)是我国重要淡水养殖鱼类，且其养殖规模和潜力越来越大。但近些年，由疱疹病毒引起的急性鲫鳃出血症给水产养殖带来严重危害，大量病死鱼还对水环境造成不良影响。该病具有突发性、流行广和致死率高的特点。急性鲫鳃出血的典型病症是鳃肿胀、出血，也伴有体表和体内组织出血。对病鲫作组织病理观察显示：除鳃之外，肝，脾，肾和头肾组织也出现不同程度的病变。研究表明，急性鲫鳃出血症就是由鲫疱疹病毒(Carassius aruatus herpesvirus,CaHV)[方进等，中国水产科学2016年3月,23(2)::336-343]所致。一旦有鱼发病，很快就在鱼群中传播，通过症状和病理来判断为时已晚。尤其在鲫鳃出血症流行区同时出现CyHVs感染，就更难鉴别。因此，需要尽快建立高效和特异的诊断方法，以便针对性的开展鲫疱疹病毒病的诊断和免疫防控。

针对上述问题，申请人在分离鉴定鲫鳃出血症病毒CaHV的基础上，完成其全基因组测序。经基因组和同源序列比对显示，CaHV与CyHVs之间存在保守序列，如：CaHV编码主要衣壳蛋白(Major capsid protein,MCP)的基因88R[Davison et al.J Virol,2013,87:2908–2922]。已通过不同聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)方法，包括TaqMan实时荧光定量PCR、环介导等温[周勇等,水产学报,2013,37(4):607-613；Gotesmanet al,Dis Aqua t Organ.2013,105(2):163–174]，扩增单一MCP基因，用于检测鱼类疱疹病毒。但在同时流行CaHV和CyHVs的地区，就难以鉴别和诊断。同源序列比对还显示，CaHV存在独特基因，如:CaHV编码肿瘤坏死因子受体(Tumor necrosis factor receptor,TNFR)的基因146R，而CyH Vs(如CyHV1和CyHV3)或缺此基因，或同源基因内存在显著差异的序列区段(见图2)。据此，我们分别设计针对CaHV一个保守基因MCP和一个独特基因TNFR的两对引物CaHV-MCP F/R及CaHV-TNFR F/R，并创建既适合诊断病毒性鲫鳃出血症，同时又能检测出CyHVs的复合PCR方法。

发明内容