[发明专利]甲胎蛋白核酸适体AFP3及其制备方法

说明书

技术领域

本发明属于球蛋白检测技术领域，涉及一种核酸，特别是涉及高特异性和高亲和 力的甲胎蛋白核酸适体及其制备方法。

背景技术

甲胎蛋白（AFP）是一种糖蛋白，正常情况下，这种蛋白主要来自胚胎的肝细胞，胎 儿出生后约两周甲胎蛋白从血液中消失，因此正常人血清中甲胎蛋白的含量尚不到20微 克/升。甲胎蛋白在产妇羊水或母体血浆中AFP可用于胎儿产前监测。如在神经管缺损、脊柱 裂、无脑儿等时，AFP可由开放的神经管进入羊水而导致其在羊水中含量显著升高。胎儿在 宫腔内死亡、畸胎瘤等先天缺陷亦可有羊水中AFP增高。AFP可经羊水部分进入母体血循环。 在85%脊柱裂及无脑儿的母体，血浆AFP在妊娠16-18周可见升高而有诊断价值，但必须与临 床经验结合，以免出现假阳性的错误。

检测甲胎蛋白的方法有好几种，放射免疫法测得的甲胎蛋白大于甲胎蛋白500 微克/升、且持续4周者，或甲胎蛋白在200～500微克/升、持续8周者，在排除其它引起甲胎 蛋白增高的因素如急、慢性肝炎、肝炎后肝硬化、胚胎瘤、消化道癌症后，需再结合定位检 查，如B超、CT、磁共振（MRI）和肝血管造影等即可作出诊断。不过，正常怀孕的妇女、少数肝 炎和肝硬化、生殖腺恶性肿瘤等情况下甲胎蛋白也会升高，但升高的幅度不如肝癌那样高。 肝硬化病人血清甲胎蛋白浓度多在25～200微克/升之间，一般在2个月内随病情的好转而 下降，多数不会超过2个月；同时伴有转氨酶升高，当转氨酶下降后甲胎蛋白也随之下降，血 清甲胎蛋白浓度常与转氨酶呈平行关系。如果甲胎蛋白浓度在500微克/升以上，虽有转 氨酶升高，但肝癌的可能性大，转氨酶下降或稳定，而甲胎蛋白上升，也应高度怀疑肝癌。目 前甲胎蛋白的检测方法有三大类：色谱法、免疫学法、循环酶法。色谱法灵敏度高、特异性 好，但样品处理、分离条件、色谱柱制备诸多变异，使其难以标准化；而且HPLC设备价格昂 贵、技术条件要求高，需专门的维护人员，使其推广困难。免疫学法需要还原游离AFP形式， 抗体荧光分析法和比浊法不能直接检测游离型同型半胱胺酸，只能检测血浆总同型半胱胺 酸，用还原剂在37℃半小时卵育对血样进行还原处理。免疫学法需一小时以上才能出结果， 操作步骤繁琐，因为需要进行还原处理可受一些不确定的因素影响。循环酶法过程繁琐，且 检测限低、产生误差较大，价格昂贵，故得不到推广。

核酸适配体是近年发展起来的一类新型识别分子，近年来受到科学家的广泛关 注，大量针对重要生理活性分子的核酸适配体被筛选出来；各种基于核酸适配体的分析方 法和技术已被报道；核酸适配体药物“Macugen”也已于2005年被FDA正式批准上市。SELEX技 术筛选得到的寡核苷酸序列被称为适配子,国内其翻译为核酸适体、核酸适配子、核酸识 体或核酸适配体等。SELEX技术是指应用化学法合成大容量的随机寡核苷酸(由两端的固 定序列和中间的随机序列组成)文库,通过施加选择压力(结合靶目标，淘选与靶目标高度 特异结合片段的过程),并结合体外扩增技术,经过多轮的循环选择富集,获得与靶物质 高度特异结合的寡核苷酸分子,可以是RNA也可以是DNA,长度一般为25~60个核苷酸。

由上可知，核酸适体与靶物质结合所呈现的高敏感性和高特异性,使其在疾病诊 断中具有良好的应用前景,尽管目前成熟的临床应用报道较少,但应用适体检测球蛋白 的研究却不断增多,基于适体的检测新技术也不断出现。但是目前基于核酸适体的针对于 甲胎蛋白的高效特异性识别研究还很缺乏，且针对于甲胎蛋白的核酸适体及其筛选制备方 法尚未见有报道。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有的甲胎蛋白检测技术的不足，填补还未见甲 胎蛋白的核酸适体及其筛选制备方法空白，提供一种甲胎蛋白核酸适体及其制备方法，本 发明所提供的核酸适体命名AFP3。

本发明的方案是通过这样实现的：一种甲胎蛋白核酸适体，其特征在于，所述核酸 适体的核苷酸序列其序列为：gagctctgactcgctaaggtcgtcatggaggtggataact ggatccaaccacctatgga。

以上所述甲胎蛋白核酸适体的衍生物，所述衍生物包括以下四种中的任意一种：

（1）将权利要求1中所述核酸适体任意位置上的碱基A、T、C或G置换成稀有碱基甲基化 嘌呤、二氢尿嘧啶或次黄嘌呤后，得到的核酸适体衍生物；