[发明专利]一种携带多位点突变型EGFR新抗原基因的重组腺相关病毒载体及构建方法和应用

权利要求书

1.一种携带多位点突变型EGFR新抗原基因的重组腺相关病毒载体的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）体外克隆野生型EGFR基因；

（2）将pAAV-MCS载体和步骤（1）中得到的野生型EGFR基因分别用限制性内切酶Sal I和Xho I进行双酶切，然后进行DNA连接反应，得到携带野生型EGFR基因的重组腺相关病毒载体pAAV-EGFR^WT；

（3）通过点突变试剂盒或PCR的方法将pAAV-EGFR^WT中R108K，A289V，S492R，G598V，G719S，S768I，T790M，C797S和L858R位点的碱基进行突变反应，得到携带多位点突变型EGFR基因的重组腺相关病毒载体pAAV-EGFR^MUT；

其中，pAAV-EGFR^WT碱基突变反应过程为：以pAAV-EGFR^WT为模板，在突变引物的引导下依次进行点突变反应，构建多位点突变型EGFR重组质粒pAAV-EGFR^MUT；所用突变引物如下：

R108K-F：GAAAACCTGCAGATCATCAAAGGAAATATGTACTACGAA；

R108K-R：TTCGTAGTACATATTTCCTTTGATGATCTGCAGGTTTTC；

A289V-F：CAAATACAGCTTTGGTGTCAC CTGCGTGAAGAAGT；

A289V-R：ACTTCTTCACGCAGGTGACACCAAAGCTGTATTTG；

S492R-F：CGGTCAGAAAACCAAAATTATACGCAACAGAGGTGAAAACAGCTG；

S492R-R：CAGCTGTTTTCACCTCTGTTGCGTATAATTTTGGTTTTCTGACCG；

G598V-F：CAAGACCTGCCCGGCAGTAGTCATGGGAGAAAACA；

G598V-R：TGTTTTCTCCCATGACTACTGCCGGGCAGGTCTTG；

G719S-F：CAAAAAGATCAAAGTGCTGAGCTCCGGTGCGTTCGGCAC；

G719S-R：GTGCCGAACGCACCGGAGCTCAGCACTTTGATCTTTTTG;

S768I-F：AGCCTACGTGATGGCCATCGTGGACAACCCCCACG；

S768I-R：CGTGGGGGTTGTCCACGATGGCCATCACGTAGGCT；

T790M-F: CACCGTGCAGCTCATCATGCAGCTCATGCCCTTCG,

T790M-R：CGAAGGGCATGAGCTGCATGATGAGCTGCACGGTG；

C797S-F：AGCTCATGCCCTTCGGCAGCCTCCTGGACTATGTC；

C797S-R：GACATAGTCCAGGAGGCTGCCGAAGGGCATGAGCT；

L858R-F：GATCACAGATTTTGGGCGGGCCAAACTGCTGGGTG；

L858R-R：CACCCAGCAGTTTGGCCCGCCCAAAATCTGTGATC；

突变反应体系为10×Reaction buffer 5μL，浓度为10ng/μL的 Sample plasmid 2μL，浓度为10pmol/μL的 primer F 1μL，浓度为10pmol/μL的 primer R 1μL，2μL dNTPmixture，1μL Muta-direct Enzyme, 38μL dH₂O；反应条件为：95℃预变性30秒，95℃变性30秒，55℃退火60秒，72℃延伸8分钟，共15个循环；最后4℃保存5分钟；

（4）测序鉴定。