[发明专利]一种检测人H3F3A基因突变的探针法及检测试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，特别涉及一种检测人类H3F3A基因突变的实时荧光定量PCRTaqman探针法及其检测试剂盒。

背景技术

神经胶质瘤简称胶质瘤，是最常见也是最恶性的原发性中枢神经系统肿瘤，确诊后5年生存率不足10％，大多数高度恶性胶质瘤患者，生存期仅为1-2年(Louisetal.，2007；Dominiketal.，2012)，其主要原因是大多数胶质瘤确诊晚，使患者错失了治疗的最佳时机。

组蛋白突变与多种癌症相关，组蛋白翻译后修饰方式出现异常，以及组蛋白修饰位置出现异常都会导致肿瘤发生。其中组蛋白H3家族蛋白3A(H3F3A)编码组蛋白变体H3.3，其K27M突变(即27位赖氨酸突变为甲硫氨酸)在儿童与成人胶质瘤中极为常见(Schwartzentruberetal.，2012)。K27在所有组蛋白H3变体中都是一个重要残基，既可以被乙酰化修饰，也可以被甲基化修饰(Buczkowiczetal.，2014)。H3.3参与活性染色质状态的表观传递，并且与复制非依赖性的染色质重塑事件密切相关(Jhaetal.，2014)。在基因表达的转录后修饰过程中，H3K27M突变位点靠近调控H3.3活性的氨基酸残基(Hylandetal.，2011)，并且与不同的转录谱相关(Schwartzentruberetal.，2012)。K27M突变改变了H3.3组蛋白变体的转录后修饰的活性位点，导致DNA甲基化与基因表达的变化，从而驱动肿瘤发生(Davidetal.，2015)。

根据H3F3A(编码组蛋白H3.3)、IDH1突变情况可将胶质母细胞瘤分成6个亚型，各个亚型DNA甲基化形式不同，儿童、成人病理机制也不同(Dominiketal，2012)。例如弥漫性真性脑桥神经胶质瘤(diffuseintrinsicpontineglioma,DIPG)是一种好发于脑干部位、进展迅速的小儿肿瘤，是小儿脑部肿瘤的主要死因。研究表明DIPG有其自身的遗传学特征，如TP53突变与缺失、组蛋白变体H3K27M突变等(Hoffmanetal.，2016)。对临床病例的分析发现，H3.3K27M突变在DIPG中很常见，大约有80％的DIPG患儿都会携带H3.3K27M这种组蛋白突变，K27M-H3.3在DIPG病人中生存期较短，而无此突变的病人生存率延长(Dong-Anhetal.，2012)。

目前对于神经胶质瘤的诊断和筛查主要建立在形态学基础之上。但胶质瘤在形态学上的异质性，以及医生诊断过程中的主观性差异，诊断的不一致性可达30％-40％。并且，基于形态学的诊断不能准确反映疾病的本质特征。当取材为肿瘤(尤其是低级别胶质瘤)边缘，或肿瘤治疗后判断是否存在复发情况时，区分这些胶质细胞是肿瘤还是反应性增生就显得十分困难。因此，现有的形态学诊断标准较大地制约了胶质瘤的临床治疗研究。往往有临床表现以及发现神经影像学和病理学异常时已经太晚，其五年生存率只有3％。近年来，分子分型方法为揭示胶质瘤发生和发展的细胞学和遗传学本质提供了可能，可极大地促进胶质瘤的靶向治疗研究。

本发明采用的荧光定量PCR方法是分子诊断领域应用的一种技术，其实时定量，是适合临床大规模使用的方法。

本发明还结合了扩增阻碍突变系统(amplificationrefractorymutationsystem，ARMS)ARMS于1989年建立，用于对已知突变基因进行检测。由于PCR过程中引物延伸是3’端开始的，所以3’末端的碱基对引物的延伸来说非常重要。根据这个原理，将突变与正常等位基因所不同的那个碱基安排在引物3’最末端，当反应进行时，如果引物3’末端碱基与模板DNA序列匹配则可以扩增，如果不匹配，则链延伸反应就会因3’,5’-磷酸二酯键形成障碍而受阻，从而达到区分检测等位基因的目的。

发明内容

为了实现对人类H3F3A基因突变的检测，从而为肿瘤病理分型、预后判断提供参考，本发明提供了一种检测人类H3F3A基因突变的实时荧光定量PCRTaqman探针法及其检测试剂盒，该探针法和试剂盒为临床上提供了一种速度快、灵敏度高、特异性强的H3F3A基因突变检测体系。

一种检测人类H3F3A基因突变的实时荧光定量PCRTaqman探针法，包括以下步骤：

(1)在H3F3AK27MPCR反应混合液中加入从样品中提取的、作为模板的人类基因组DNA，形成H3F3AK27M反应体系并进行荧光定量PCR扩增，其中：