[发明专利]验证内核糖体插入位点IRES活性的双荧光蛋白报告系统

权利要求书

1.一种验证内核糖体插入位点IRES活性的双荧光蛋白报告系统，其特征在于，所述双 荧光蛋白报告系统的表达框架的核苷酸序列如SEQIDNO：1所示。

2.权利要求1所述双荧光蛋白报告系统的构建方法，所述方法包括以下步骤：

(1)通过全基因化学合成，获得如SEQIDNO：1所示的目标核苷酸序列；

(2)通过NheI和XhoI，将步骤(1)获得的所述目标核苷酸序列连接到表达载体 pcDNA3.1(+)中。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，采用PCR扩增的方法 在设计引物的时候引入NheI和XhoI酶切位点序列。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述引物的序列为：

primer-F0：5’–GCGCTAGCATGAAGGGCGAGGAGGATAAC-3’

primer-R0：5’–CGCTCGAGTTACTTGTACAGCTCGTCCATG-3’。

5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述PCR扩增的反应体系如下：PCR为50 μl总体系：具体是2×PCRMIX15μl，10mM上下游引物各2μl，化学合成的基因框架SEQID NO.1模板1μl，用灭菌去离子水补足50μl体系；反应条件为：95℃5min预变性，循环内 95℃30s变性，60℃30s退火，72℃延伸1min30s，共35个循环，PCR反应循环后72℃继 续延伸7min，然后4℃保存。

6.根据权利要求3至5任一项所述的方法，其特征在于，将所述PCR扩增的产物回收 纯化，然后对其用NheI、XhoI酶切后，同时pcDNA3.1(+)载体也用同样的内切酶切割，然后 将酶切后的PCR产物构建到酶切后的真核表达载体pcDNA3.1(+)中。