[发明专利]从毕赤酵母中分离的鼠李糖诱导型启动子及其应用

说明书

本发明公开了鼠李糖诱导型启动子及其应用。本发明首先公开了从毕赤酵母中分离的核苷酸序列为SEQ ID NO.5所示的鼠李糖诱导型启动子，验证了所述鼠李糖诱导型启动子启动外源基因表达的强度，并确证了能有效调控目的基因表达的最短启动子。本发明还公开了含有所述鼠李糖诱导型启动子的重组真核表达载体及宿主细胞。本发明进一步提供了一种调控目的异源性基因在毕赤酵母中进行适时表达的方法，包括：用所述的鼠李糖诱导型启动子和待表达的目的异源性基因构建真核表达载体；将构建的真核表达载体转化到酵母中得到重组酵母；通过控制培养基中诱导物鼠李糖的添加量和添加时间来调控目的蛋白适时的表达，实现外源蛋白表达的精确控制。

技术领域

本发明涉及启动子，尤其涉及一种从毕赤酵母(Pichia pastoris)中分离鉴定的鼠李糖诱导型启动子，本发明还涉及含有该鼠李糖诱导型启动子的重组真核表达载体及重组宿主细胞，本发明进一步涉及该诱导型启动子在调控外源基因在真核细胞中进行适时表达等方面的应用，属于鼠李糖诱导型启动子的分离及应用领域。

背景技术

真核生物巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)表达系统以高密度发酵、发酵工艺成熟、发酵成本低、产物易分离等优点而广泛用于外源蛋白的表达(Damasceno等人，2012，Applied Microbiology and Biotechnology，93:31-39)。基于甲醇氧化酶1基因启动子开发的pPIC9系列载体得以最广泛使用(Nie等人，2013，Protein Expression andPurification 92：88-93；Hao等人，2013，Protein Expression and Purification，90：178-185)，然而应用这类载体生产重组蛋白时存在较多弊端：实验室小规模发酵时，涉及到菌体扩增培养基置换为诱导培养基的繁琐过程；大规模发酵时，涉及大量甲醇存放、使用等，存在较大的安全风险；甲醇作为有毒物质，难以应用于医药级和食品级的基因工程产品的生产。另外，基于组成型强启动子—三磷酸甘油醛脱氢酶启动子的表达载体也得以广泛应用，但这类表达系统也存在诸多弊端：目的蛋白在整个发酵期间持续表达，难以实现外源蛋白表达时序性精确控制；目的蛋白对宿主细胞生长有毒害时，无法实现目的蛋白的高效表达。因此，开发基于无毒诱导物的强启动子的表达载体是克服以上两种表达载体弊端的有效途径。

鼠李糖代谢基因的转录受到严格调控，相关基因的启动子为目前报道的最为严谨的分解代谢基因的启动子，基于此类启动子的表达系统和改良工作也不断涌现。应用基于E.coli鼠李糖诱导型启动子的表达载体实现了重组蛋白N-氨甲酰氨基酸水解酶高水平表达(3.85g/L)(Wilms等人，2001，Biotechnology and Bioengineering，73:95-103)。Wagner构建的由鼠李糖诱导型启动子调控T7RNAP抑制蛋白T7Lys表达的载体，只需简单地改变鼠李糖浓度来调节T7Lys表达量进而调控T7RNAP活性，实现了多个难以表达的膜蛋白在大肠杆菌中成功表达(Wagner等人，2008，PNAS，105：14371-14376)。2012年，Lucigen公司则开发了基于E.coli为宿主和E.coli鼠李糖诱导型启动子的Expresso Rhamnose表达系统，表达强度稍弱于常用的T7表达系统；但对于易于集聚的蛋白来说，这种适量低表达的系统有良好的应用效果。构建基于鼠李糖诱导启动子的表达系统可时序性调控目的基因的表达，在基础理论(如基因功能的阐明)和生产实践(如构建高效表达系统)以及抗生素等细胞毒性物质的筛选上均有良好应用。

2009年和2011年，De Schutter和Kuberl相继完成P.pastoris基因组测序和基因注释，其中基因PAS_chr1_4-0075被注释为鼠李糖脱水酶基因。构建基于PAS_chr1_4-0075启动子的P.pastoris表达载体，不仅可避免使用危险物甲醇，还可通过控制诱导物的添加量和添加时间来调控重组蛋白适时地表达，将在基础研究和生产实践上均有重要价值。

发明内容