[发明专利]基于四环素调控系统检测叶绿体启动子活性的方法

说明书

本发明涉及一种基于四环素调控系统检测叶绿体启动子活性的方法，属植物质体基因工程研究技术领域。本发明的方法以四环素基因及四环素特异性识别序列的核心操控区为基础，生物合成带有四环素核心操控区的prrnO1O2启动子，并在原核细胞中验证该启动子的活性，在该启动子的驱动下GFP基因表达；构建四环素诱导表达载体，筛选出适应细菌生长的最高四环素使用浓度为5μg/mL；最后构建四环素调控系统下的GFP表达载体，在未加入四环素时，prrnO1O2启动子的功能被抑制，加入四环素后，GFP基因表达出绿色荧光蛋白。本发明的有益效果在于：利用四环素调控系统控制叶绿体启动子的活性，从而避开了核基因组对质体基因组的调控干扰，为进一步的质体基因工程育种提供有有效的方法和途径。

技术领域

本发明涉及一种基于四环素调控系统检测叶绿体启动子活性的方法，属植物质体基因工程研究技术领域。

背景技术

叶绿体基因工程是伴随着叶绿体基因组研究的不断深入而出现的，目前叶绿体基因组转化技术已在烟草、番茄、马铃薯、拟南芥、大豆、胡萝卜、花椰菜、油菜、水稻和棉花等高等植物中获得了成功。

与细胞核转基因技术相比，叶绿体基因转化具有明显的优势。（1）、通过DNA片段同源重组，可以精确地控制外源基因的插入位点；（2）、安全性及稳定性好。绝大多数植物的叶绿体基因为母系遗传，大大降低了基因扩散所引起的生态风险性；（3）、外源基因可得到超量表达。叶绿体转基因植物中，外源基因的表达量通常比核转化植株的表达量高出数十倍至数百倍。表达产物的区域化，也为目标蛋白的提取提供了方便。

大肠杆菌的四环素抗性操纵子的启动子区存在着两个基本相同的操纵序列(operator)，转座子Tn10编码的TetR（tet repressor）蛋白可以与上述操纵序列紧密结合，阻止转录起始复合物的形成，从而达到从转录水平抑制四环素抗性基因的表达。当外源的四环素分子穿过大肠杆菌细胞膜进入细胞后，可特异结合TetR蛋白，使其构相改变,从操纵序列解离下来，于是转录起始复合物可以形成。四环素调控系统具有独特之处：（1）、关键元件均来自原核生物，由于原核与真核生物基因组的巨大差差异，该系统对真核基因组的表达几乎没有影响；（2）、原核基因缺乏多效性，简化了对转基因表型的解释；（3）、该系统的诱导因子是抗生素，与其他调控系统的诱导 (如热休克、激素等)相比，在活体内不具有多态效应；（4）、诱导所需的Tc剂量较低，对细胞和哺乳动物是无害的；（5）、外源基因表达的水平与所加的Tc浓度在一定范围内相关，可通过控制Tet的浓度来控制基因表达的水平，了解基因不同水平的表达对细胞。

目前对Tet调控系统已经广泛应用于医学治疗，是目前应用最广的一种诱导系统，与Cre/loxP重组酶系统联合应用控制Cre重组酶基因的表达，但在很多植物上至今还未得到成功，四环素诱导表达系统在质体基因工程上的报道更是甚少。

发明内容

本发明的目的在于提供一种基于四环素调控系统检测叶绿体启动子活性的方法。通过四环素调控系统控制叶绿体基因的表达，为今后质体基因工程的研究提供一种有效的方法。

一种基于四环素调控系统检测叶绿体启动子活性的方法，其特征在于该方法的具体步骤如下：