[发明专利]一种用于内耳毛细胞定向转染的纳米基因载体复合物及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，特别是涉及一种用于内耳毛细胞定向转染的纳米基因载体复合物及其制备方法。

背景技术

感音神经性耳聋主要是由听觉感受器官—耳蜗的变性引起的。对人类颞骨解剖学研究发现，感音神经性耳聋可由耳蜗多种细胞类型的变性引起，其中，承担将声音信号转换为电信号的毛细胞病变，是目前针对感音神经性耳聋研究的核心问题之一。以往，研究者们认为在哺乳动物体内，耳蜗毛细胞损伤变性后是不可再生的。

近年来，有研究发现将包含毛细胞分化的关键基因---Atoh1基因的质粒导入体外培养的Corti器中，可以产生异位的毛细胞，本研究小组前期，利用腺病毒作为载体将Atoh1基因成功介导转染至噪声性聋的豚鼠耳蜗内，发现噪声损伤的豚鼠耳蜗过表达Atoh1基因，可使受损耳蜗内产生大量新的内外毛细胞纤毛簇，促进听功能的恢复。

既往关于将Atoh1基因及其同源基因转入内耳的研究采用的基因载体大多为病毒类基因载体---腺病毒等。目前，常见的基因载体有病毒载体和非病毒载体两大类。腺病毒载体属于病毒载体的一种，具有较高的转染效率，目前被广泛应用。但病毒载体存在明显的缺点，如可能诱导宿主免疫反应、存在潜在致癌性，制备条件复杂，细胞转染缺乏特异性，且病毒载体所能装载的外源DNA大小相对有限。此外，病毒载体导致的宿主基因重组是限制其临床应用的另一个安全隐患。

因此，针对病毒载体的上述缺点，我们转向非病毒载体的研究。非病毒制备简单，载基因容量大，且不会诱发宿主的免疫反应。而纳米颗粒又由于具备较高转染效率及特异性靶向作用，以及部分可生物降解性、低毒性、无免疫原性等特点，是理想的基因载体选择。其中，阳离子聚合物载体具有良好的结合和保护DNA的能力，易制备成纳米颗粒，能较易实现生物靶向性及生物适用性改造，是目前基因非病毒载体的一个重要研究对象。

既往关于内耳非病毒基因载体的研究发现了数个能实现有效内耳基因转染的阳离子聚合物纳米颗粒载体，如Wu N等研制了一种基于PAMAM的羧甲基β-环糊精分子修饰聚酰胺胺纳米载体携带Atoh1基因，通过圆窗膜途径将复合物导入内耳， 术后7天发现内毛细胞的转染效率可达47.57±6.68％，外毛细胞的转染效率则可高达82.14±9.67％，实现了Atoh1基因向大鼠耳蜗的成功递送。但PAMAM衍生物合成过程复杂，制备过程可控性较差，合成产物稳定性不佳，因此无法进行进一步的推广，且既往的内耳转染研究均未报道能实现针对于毛细胞的定向转染。

因此，我们选择了聚乙烯亚胺(polyethylenimine，PEI)。PEI是目前最热门的非病毒基因载体材料之一，也是目前最为广泛研究的阳离子聚合物基因载体材料，在体外具有较高的转染效率。在结构上，PEI可分为直链型(linear Polyetherimide,lPEI)和分支型(branched Polyetherimide,bPEI)两种结构。以往大部分的实验研究均采用分支型PEI，其内含有大量的伯仲叔三种氨基，质子缓冲区间大，即具有独特的“质子海绵效应”，在PEI-DNA纳米复合物通过内吞作用进入细胞后，在溶酶体内逐渐累积，致使溶酶体的渗透性逐渐增强，在无需溶酶体溶解肽辅助作用下即可使溶酶体破裂，释放内吞的DNA至胞质。然而，PEI等合成型阳离子聚合物都有一定的毒性，其基因转染效率和毒性与其分子量有关。高分子量的PEI(如25kDa PEI)，带有较多的正电荷，因此具备较高的结合DNA的能力，而具有较高的转染效率，但因PEI在体内不可降解，因此过高的电荷密度也导致较大的细胞毒性，在体内应用受到限制。低分子量PEI(如<2kDa PEI)毒性较小，但所带的正电荷也少，不能有效结合及完全包裹DNA，载体稳定性差，转染效率也不高。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对上述现有技术中的问题，提供一种新的纳米基因载体复合物及其制备方法，该方法合成过程易操作、稳定性强、可实现内耳毛细胞的定向转染，达到治疗受损毛细胞的目的。

本发明为了解决上述技术问题，所采取的技术方案为：

本发明提供了一种用于内耳毛细胞定向转染的纳米基因载体复合物，其中，所述纳米基因载体复合物包括由透明质酸修饰的PEI载体以及由所述载体运载的Atol1基因。

作为优选地，本发明所述的PEI载体为25kDa的bPEI纳米颗粒。

本发明选择的目的基因为可以任意动物的来源的Atoh1基因，例如，小鼠、大鼠、兔和猪等动物的Atoh1基因以及人的Atoh1基因，具体来源根据实际需要选择。