[发明专利]一种快速检测肿瘤相关小肽MUC1的方法

说明书

本专利公开了一种快速检测肿瘤相关小肽MUC1的方法，涉及荧光探针检测技术领域。利用适配体与目标小肽特异性识别的特点，设计特殊适配体序列，从而达到目标物特异性识别的目的；通过结合两种发卡结构探针的杂交反应完成信号放大的策略，从而实现目标小肽的灵敏检测。本方法包括探针预变性‑混合反应‑背景猝灭‑荧光检测等四个步骤，操作简便快速，省时省力，为肿瘤相关小肽MUC1的检测提供一种新的方法。

技术领域

本发明涉及荧光探针检测技术领域，更具体地说是一种以适配体特异性识别和两种发卡探针杂交反应放大的方式构建的荧光检测小肽方法。

背景技术

近几年来国民癌症发病率及死亡率呈现逐步走高的趋势，因此寻找快速、定量、灵敏的检测肿瘤标记物的方法在早期检测和治疗监控中非常重要。目前癌症相关肿瘤标志物主要有酶、激素、抗原、小肽和小分子RNA等。小肽作为人体内蛋白质水解后的产物在氨基酸的消化、吸收等方面起到重要的作用。当人体细胞产生癌变后，癌细胞新陈代谢与正常细胞会有很大的差别，癌细胞也会产生小肽类物质，因而通过检测小肽的含量水平，人们能够能及时发现癌变细胞，从而达到疾病早期预警的目的。

小肽MUC1，又叫CA15-3，在参与信号传输以及调控免疫细胞生长与凋亡等方面有重要作用。MUC1在大多数人类腺癌里都有表达，并且还是已经商品化的血清癌症标志物检测方法里的抗原。肿瘤组织的MUC1在癌细胞表面会产生反常，即糖基化相对于正常细胞不完全。由于MUC1特异性高于一般抗原，敏感性高于癌胚抗原，因而在癌症检测方面被作为癌症标记物来应用。

为了解决小肽在低浓度下也能进行检测的问题，小肽识别和信号放大策略变的尤为重要。然而，目前检测小肽的方法，如酶联免疫吸附测定、无需标记的表面等离子共振、液相色谱-质谱以及电化学分析的方法虽然具有较高的灵敏度和特异性，但是都需要一系列的固定、分离和清洗步骤，耗时、费力。因此发展一种既能特异性识别，又能够检测到低浓度小肽的方法具有重要意义。适配体能与靶分子特异性结合的特点以及发卡探针杂交链式反应放大信号的优势正好能解决上述问题，且操作简单、省时省力。

发明内容

本发明要解决的技术问题是构建一种特异性识别小肽MUC1以及能实现后续信号放大的小肽检测方法。

一种快速检测肿瘤相关小肽MUC1的方法，其特征是包括以下步骤：

（1）探针预变性

首先，羧基荧光素FAM标记的发卡探针1和发卡探针2以及适配体，英文名称为aptamer，在95 ºC下分别孵育0.5 h；将这三种溶液在室温条件下放置1 h；

（2）混合反应

以下步骤进行的总反应混合液体积为200 µL，不同浓度的粘蛋白MUC1与浓度为10-50 nM的发卡探针1、浓度为10-50 nM的发卡探针2和浓度为5-10 nM的适配体混合于缓冲溶液中，混合溶液在25 ºC下反应1 h；

缓冲溶液的成分为浓度为0.75 M的氯化钠和50 mM的磷酸氢二钠，pH值为7.4；

（3）背景猝灭

向（2）所述步骤中得到的混合溶液加入浓度为0.5 mg/mL氧化石墨烯溶液，25ºC下孵育0.5 h；

（4）荧光检测

荧光检测的实验参数如下：激发波长为480 nm，发射波长范围为500-650 nm。

本发明的有益效果

（1）利用适配体技术，能够实现目标物小肽MUC1的特异性识别；

（2）利用发卡探针1和发卡探针2之间的杂交链反应，实现荧光信号快速放大；

（3）本发明所述方法操作简单、反应快速。