[发明专利]烟草西柏三烯一醇合成酶基因启动子及其应用

说明书

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体涉及一种烟草西柏三烯一醇合成酶基因启动子及其应用。

背景技术

腺毛是烟草叶面分泌物的分泌器官，主要分泌西柏烷类化合物，占叶面化学成分的60%以上。在西柏烷类化合物中，西柏三烯二醇含量远远高于西柏三烯一醇，β-西柏三烯二醇含量稍高于α-西柏三烯二醇。在烟叶烘烤调制和陈化过程中，西柏烷类化合物降解产生茄酮及其衍生物等香味成分，是构成烟叶品质的重要组成成分。此外，西柏烷类化合物不仅对改善烟草的品质有极其重要的作用，对抵抗蚜虫和烟草花叶病的侵袭也有良好的抗性。

在烟草腺毛中，类萜代谢前体物有甲羟戊酸（MVA）途径和丙酮酸/3-磷酸甘油醛代谢（DXP）产生异戊烯焦磷酸（IPP）。IPP是合成萜类化合物的前体，MEP途径存在于质体中，为单萜、双萜、四萜生物合成提供IPP。IPP被IPP异构酶（IPI）和二价金属离子转化为具有活性的异构体DMAPP。IPP和DMAPP在牻牛儿基焦磷酸合成酶(GPPS)的作用下缩合成牻牛儿基焦磷酸(GPP)，然后GPP再与2个IPP在牻牛儿基焦磷酸合成酶(GGPPS)的作用下缩合成牻牛儿基焦磷酸(GGPP)。GGPP在二萜合成酶的作用下生成二萜，分为两步：第一步，GGPP为二萜的形成提供了C₂₀骨架结构，在西柏三烯一醇合成酶CBTS的作用下，GGPP发生环化反应，生成α-和β西柏三烯一醇(CBT-ol)；第二步，在P450羟化酶CYP71D16的作用下，西柏三烯一醇发生羟化反应生成α-和β西柏三烯二醇(CBT-diol)。WangE等最先克隆了腺毛特异P450羟化酶基因CYP71D16，并对其功能进行了研究，认为该基因编码的是CBT-ol羟化酶，能将西柏三烯一醇转化为西柏三烯二醇。Hanane等以普通烟草腺毛特异性基因西柏三烯一醇合成酶（CYC）设计的引物从烟草中克隆出CBT基因，对其调控位点进行研究，认为CBT的产物能将GGPP催化成西柏三烯一醇，同时发现CBT和CYP71D16只能在烟草腺毛中特异表达。西柏三烯一醇合成酶可以调控西柏三烯一醇的合成。而编码该酶的基因CYC的启动子可以在转录水平对该基因的表达进行调控，因此，克隆和分离CYC基因的启动子并找到对应的调节元件是实现西柏三烯烷类合成的重要前提。

发明内容

为解决以上问题，本发明提供一种烟草西柏三烯一醇合成酶基因启动子，其驱动的GUS基因只在腺毛上特异表达，且在不同温度下的活性不同，在28℃条件下具有较高活性，可实现GUS基因的高水平表达。

为解决以上技术问题，本发明通过以下技术方案实现:

烟草品种8306是杨铁钊等培育出的高香气烤烟新品系，具有典型的烤烟香味，香气突出，显著高于其它烤烟栽培品种；且经过连续8代的自交选择，遗传性状表达稳定。本发明从8306中克隆出烟草西柏三烯一醇合成酶（CYC）基因启动子，构建pC-NtCYC-pro-GUS载体，转化烟草K326，利用报告基因GUS对NtCYC基因启动子的特异表达进行研究，并深入研究了该NtCYC基因启动子在对环境的应答机制，建立了烟草腺毛基因过表达体系，进一步为在腺毛中研究基因功能奠定了基础。

研究发现了一种烟草西柏三烯一醇合成酶基因启动子，其核苷酸序列为：

（1）SEQIDNO.1所示的核苷酸序列；

（2）SEQIDNO.1所示的核苷酸序列经重复、缺失、替换或移位等常规技术手段改造而形成的具有同等功能的核苷酸序列。

设计一种嵌合基因，其中包含上述烟草西柏三烯一醇合成酶基因启动子以及与之可操作连接的、编码目的基因的序列。

一种植物转化载体，其中包含上所述嵌合基因。

一种转基因植物细胞，其中包含上述嵌合基因。

一种转基因植物组织，其中包含上述嵌合基因。

利用上述烟草西柏三烯一醇合成酶基因启动子对温度敏感响应的特性，可将其应用于烟草西柏三烯一醇合成调控过程，以改善烟草的品质，并提高烟草抵抗蚜虫和烟草花叶病的抗性。

本发明具有以下积极有益技术效果：

发现并克隆出了一种对温度敏感响应的烟草西柏三烯一醇合成酶基因启动子，其驱动的GUS基因只在腺毛上特异表达，且在不同温度下的活性不同，在28℃条件下具有较高活性，可实现GUS基因的高水平表达，为灵活调控西柏三烯一醇的合成找到了有效的实现途径。

附图说明

图1.“8306”NtCYC启动子的PCR扩增电泳图；

孔道M为Marker，孔道1～2为“8306”NtCYC启动子。