[发明专利]一种提高千层塔外植体表面灭菌效率的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及种一种提高千层塔(Huperzia serrata(Thunb.)Trev.)外植体表面灭菌效率的方法。

背景技术

千层塔(Huperzia serrata(Thunb.)Trev.)为石松目(Lycopodiales)石杉科(Lycopodiaceae)石杉属(Lycopodium L.)多年生草本蕨类植物。千层塔始载于《植物名实图考》，性味辛苦、平。具有散瘀消肿、解毒和止痛的功效。1927年我国科技工作者报道了从该植物中分离的石杉碱甲具有横纹肌松弛作用，之后的大量研究发现石杉碱甲是一种高效、低毒、可逆和高选择性的乙酰胆碱酯酶抑制剂。现在，被石杉碱甲及经作为治疗阿尔茨海默病(AD，Alzheimer disease)的药物，同时在美国被用做益智的营养保健品。

但是，千层塔自然资源严重短缺。千层塔生长缓慢，野生状态下千层塔的繁殖主要以孢子繁殖为主，孢子萌发周期长，萌发后属地下生配子体，需6-15年才能成熟。因此极大地限制了千层塔野生资源的再生。千层塔中的石杉碱甲含量又很低(0.007％)，再加上其全合成石杉碱甲步骤繁琐、价格昂贵且有副作用。目前，石杉碱甲的提取主要依赖于野生资源，提取率仅为0.006％-0.1％，因而大量的市场需求、受限的自然资源和自身生长繁殖的限制。因此，不论是石杉碱甲直接或者间接获得都是以千层塔的原植物为原料，这种自然界有限的资源将处于灭绝的边缘。利用植物组织培养可进行珍稀和濒危药用植物的微繁殖，建立高效和稳定培养系，培育出脱毒的优质品种，解决珍稀濒危药用植物人工种植存在的种子稀少、种苗奇缺、种质退化等严重问题，为千层塔的资源再生和可持续利用提供技术手段。

但是，千层塔组织培养过程主要采用的是叶片、茎和根。这些外植体存在外植体灭菌困难、无菌外植体获得率低，而且灭菌后大部分死亡，不能生长、分化和增殖等问题。因此，对于千层塔的组织培养，外植体的灭菌至关重要。

发明内容

本发明的目的在于，提供一种提高千层塔外植体表面灭菌效率的方法，该方法能够显著千层塔外植体表面的灭菌效率，同时提高了千层塔外植体的存活率。

为了实现上述任务，本发明采取如下的技术解决方案：

一种提高千层塔外植体表面灭菌效率的方法，该方法包括在低压环境中将千层塔外植体采用灭菌剂进行灭菌，灭菌后的千层塔外植体在低压环境中培养。

具体的，所述的低压环境是指压力为40～60KP。

更具体的，所述的千层塔外植体指千层塔的根、千层塔的茎或千层塔的叶。

进一步的，千层塔外植体采用灭菌剂进行灭菌包括：取千层塔外植体依次经流水冲洗、体积分数为75％的乙醇溶液浸泡、体积分数为5％的NaOCl溶液浸泡及体积分数为7％的过氧化氢溶液浸泡，千层塔外植体经NaOCl溶液和过氧化氢溶液浸泡时处于低压环境。

具体的，千层塔外植体在NaOCl溶液中浸泡的低压环境时间为5～15min，千层塔外植体在过氧化氢溶液中浸泡的低压环境时间为5～10min。

另外，将经过灭菌剂灭菌处理的千层塔外植体转接到MS固体培养基上于低压环境中培养，2周后取出千层塔外植体转移到常压培养室继续培养。

还有，低压环境中培养的光照强度为2000Lux，低压环境中培养的光周期为16h；在常压培养室中的培养的温度为25℃。

进一步的，在所述的MS固体培养基中添加100～200mg/L的两性霉素B。

优选的，所述的低压环境中培养的培养温度为30～40℃。

本发明的优点为：

(1)本发明通过低压结合温和的灭菌剂处理，以及灭菌后的低压和高温培养，不仅提高了千层塔外植体的灭菌效率，同时还提高了千层塔的移栽成活率，可用于千层塔的组织培养，为千层塔的灭菌培养提供了新思路；

(2)对千层塔外植体灭菌，最好的方案是：灭菌时，5％NaOCl浸泡时间为10分钟，7％过氧化氢浸泡时间为8分钟，两种灭菌剂浸泡时的压力为50KP；灭菌后前两周培养时，MS固体培养基中含有的两性霉素B的浓度为150mg/L，培养的压力为50KP，培养的温度为35℃。两周后进行正常的培养。在这样的条件下，千层塔的叶片除菌率和存活率分别达到60％和75％；千层塔的茎除菌率和存活率达到55％和78％；千层塔的根除菌率和存活率分别达到55％和58％。

具体实施方式