[发明专利]一种右旋糖酐酶冻干粉的工业化生产方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种右旋糖酐酶冻干粉的工业化生产方法，属于生物技术领域。

背景技术

右旋糖酐酶是一种将右旋的高分子糖酐催化降解为低分子量多糖的酶。该酶及其催化产物在医药、食品、化工等工业领域具有重要的应用价值与广泛的工业用途。如制药行业用右旋糖酐酶制备中、低、小分子量的右旋糖酐；制糖工业生产中用于提高收率及产品质量；用于龋齿的防治及龋齿疫苗的开发；如食品添加剂行业；如在人们使用的牙膏添加保护牙齿等；酶催化反应条件单一、温和、能源消耗少等特点。

众多微生物如细丽毛壳、青酶、曲霉、链球菌、申克孢子丝菌、镰刀霉菌、口腔拟杆菌等都可产右旋糖酐酶。目前，商品化的右旋糖酶主要是从自然界中筛选自身产右旋糖酐酶的细菌或真菌，进而通过各种诱变方法选育高产右旋糖酐酶、性状优良的突变株。此外，培育基因工程菌生产右旋糖酐酶也是极具发展前景的路线。相对国外而言，我国关于重组右旋糖酐酶的研究较少。近年来，甲醇诱导型毕赤酵母工程菌产外源右旋糖酐酶是研究右旋糖酐酶的重点。Roca等通过5L发酵罐培养获得了酶活为3000U/mL的右旋糖酐酶，Chen等用5L发酵罐培养获得了83.9U/mL的酶活。然而，通过基因工程获得的菌株，由于后期质粒的丢失，因此，菌株不稳定。

发明内容

针对上述问题，本发明提供了一种右旋糖酐酶冻干粉的工业化生产方法。本发明右旋糖酐酶冻干粉的生产菌为GL35-3，菌种从广西北海甘蔗田的土壤中分离获得。所述菌株GL35-3的菌种保藏编号为CGMCCNo.11945；保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏日期为2015年12月28日；保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，分类命名为细丽毛壳Chaetomiumgracile。

一种右旋糖酐酶冻干粉的工业化生产方法，步骤如下：

(1)一代斜面的制备

将菌株接种到一代斜面培养基上进行一代斜面培养，在28℃，湿度为40-60％的条件下培养6-7天；

(2)二代斜面的制备

将一代斜面培养基上活化的菌株接种到二代斜面培养基上进行二代斜面培养，在28℃，湿度为40-60％的条件下培养6-7天；

(3)种子培养

将二代斜面培养的菌株制作菌悬液，按1.5-2％(体积比)的量接种入种子培养基中，开启搅拌转速80转/min、在27-29℃条件下培养30-40h；种子培养30-40h时，pH为3.65-4.30，单位酶活为8-12u/mL，菌种的质量浓度大于15％，总糖含量(质量浓度)大于等于0.15％。

(4)发酵培养

将种子液按1.5-2％(体积比)的量接种入发酵培养基中，在27-29℃，转速为80转/min的条件下培养85-100h；培养过程中菌种的生长速率小于10g/h。

培养基

一代斜面培养基：蔗糖1.5g、马铃薯20g、琼脂2g，加水定容至100mL。

二代斜面培养基：蔗糖1.5g、马铃薯20g、琼脂2g，加水定容至100mL。

种子培养基：酵母浸粉5-10g/L,磷酸氢二钾2-4g/L，硫酸镁0.2-0.5g/L,氯化钾0.1-0.3g/L，右旋糖酐大分子100010-15g/L，硫酸亚铁0.005-0.01g/L，甜菜碱消沫剂0.001-0.005g/L，磷酸氢二钠0.005-0.01g/L，其余为自来水。

发酵培养基：酵母浸粉10-15g/L,磷酸氢二钾2-4g/L，硫酸镁0.2-0.5g/L,氯化钾0.1-0.3g/L，右旋糖酐大分子100010-15g/L，硫酸亚铁0.005-0.01g/L，甜菜碱消沫剂0.01-0.05g/L，磷酸氢二钠0.005-0.01g/L，其余为自来水。

本发明中酵母浸粉购自安琪酵母股份有限公司，批号2014110603A9，FM902型酵母浸粉。

(5)发酵培养结束，检测发酵液的单位酶活，利用蒸汽通过盘管将发酵液加温到60℃，进行灭活；

(6)经过灭活的发酵液，通过0.5mm孔板过滤器；主要是去除发酵液中颗粒状杂质或发酵过程中可能带入的异物，过滤液进入发酵液储罐。

(7)发酵液经过0.5mm孔板过滤器过滤后，再通过带式过滤机，将95％以上的菌体进行截留。

(8)料液经过带式过滤机后送入超滤膜循环罐内的物料通过膜的保安过滤器(主要防止异物进入膜系统，造成膜的损伤)，进入超滤膜，去除分子量大于200道尔顿的物质，接着清液进入纳滤膜储罐。