[发明专利]一种脐带动脉和静脉血管周干细胞的制备和保存方法

权利要求书

1.一种脐带动脉和静脉血管周干细胞的制备方法，包括以下步骤：

1）在无菌条件下于健康产妇分娩后立即取新生儿脐带，挤出脐带血管内血液，将其放入提前盛有含5%青链双抗、1%肝素、磷酸盐缓冲盐的广口瓶中，放在4℃保存，4h内进行脐带间充质干细胞的分离与培养；

2）从步骤1）中广口瓶中取出新生儿脐带，剪去有钳夹痕及血肿的部分，挤出脐带中的血，用剪刀修齐两断面，用眼科剪将脐带纵向剪开，用镊子钝性分离动脉血管和静脉血管，将血管外膜周围紧贴血管的胶组织剔除干净；

3）步骤2）处理后将脐动脉、脐静脉分别用预热的磷酸盐缓冲盐清洗，将血迹完全洗净；用剪刀将脐静脉、脐动脉剪成0.5cm的小段，分别在培养皿中整齐排开，钝性按压，使组织块紧贴在100mm培养皿底；

4）步骤3）处理后放置在5%CO₂、37℃培养箱内，倒置培养3小时；

5）步骤4）处理后加入3ml细胞培养液，然后置于5% CO₂、37℃培养箱内继续培养，培养至4-5天时将培养皿从培养箱中取出，补加细胞培养液，每隔2-3天补加细胞培养液，至第11-14天时清除所有组织片并继续培养；此后每2-3天更换一次8-10ml细胞培养液，所述细胞培养液由DMEM低糖、10%胎牛血清、1%青链霉素双抗组成；

6）当培养皿中的贴壁细胞达到80%-90%融合时，弃去培养基，用磷酸缓冲盐溶液清洗，加入0.25%胰酶消化，置于5% CO₂、37℃培养箱孵育60-90s，倒置显微镜下观察消化细胞，若胞质回缩，细胞之间不再连接成片，表明此时细胞消化适度；轻轻从侧部拍打培养皿数下，加入细胞培养液，反复吹打，使脐带血管周干细胞尽可能混于消化液中；后将悬液吸至离心管中，1250rpm离心5min，弃上清，重新用细胞培养液悬浮细胞，接种于100mm培养皿中进行传代培养；此后每2-3天换液一次，直至融合率达到80-90%后，消化传代；

7）扩增后细胞进行病原生物学检测，同时进行表型检测。

2.权利要求1所述的制备方法，其中还包括将所制备获得的脐带动脉和静脉血管周干细胞进行保存的步骤，所述步骤包括：将制备获得的血管周干细胞用0.25%胰酶消化，1250rpm、5min离心收集细胞，负压吸引器吸掉离心管中细胞上清，先沿离心管口稍下方侧壁缓慢加入预计冻存液的一半，再将吸管的头部伸入液面以下缓慢加入另一半冻存液后，轻轻吹打混匀后将细胞悬液分装于冻存管中，所述冻存液由90%胎牛血清、10%二甲基亚砜组成；冻存管置于4℃保持30分钟，然后置于-20℃下保持2小时，再置于-80℃下保持16-18小时后液氮罐长期储存。