[发明专利]利用SSR指纹图谱鉴别黄魁茶树品种的方法

说明书

本发明提供一种利用SSR指纹图谱鉴别黄魁茶树品种的方法，涉及到茶树全基因组中特异的SSR标记(SEQ ID No:1)及引物(SEQ ID No:4和5)。利用四份省级茶树优良品种作为样本材料，在茶树全基因组中选取415对SSR引物进行多态性筛选，最终确定1对引物作为黄魁品种鉴定的核心SSR引物，可有效将黄魁和其它三个省级茶树品种区分开，不仅有利于黄魁品种的保护及推广，还对市售黄魁茶的真伪鉴别提供了一个快速、准确的方法。

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，具体地说，涉及一种利用SSR指纹图谱鉴别黄魁茶树品种的方法。

背景技术

黄化茶是由老茶树或老茶树上的部分茶枝受到外界环境因素的影响发生自然变异由原来的绿色变为黄色。这一黄化过程的机理比较复杂，外界环境不同，其黄化程度也不同。黄魁属于黄化茶之一，其特点是干茶嫩黄荷香、茶汤杏黄醇厚、叶底金黄富贵，茶氨酸和叶黄素含量高。黄魁茶树原种来源于安徽省郎溪县毕桥镇地方茶树群体中的自然变异单株，通过单株选育出具有优良性状的茶树黄化新品种——“黄魁”。“黄魁”茶树树姿呈半开状，芽叶呈金黄色，茸毛较少，发芽率高，每年的亩产量约120斤，黄魁品种适应性强，适合生长在地山丘陵地带。

近几年随着我国黄化茶新品种不断增多，市场上不同品种的黄化茶仅凭肉眼从外观形态上很难区分，随着国家对植物新品种保护制度的不断完善，急需开发有效的技术措施对黄魁新品种进行精准鉴定。本发明利用SSR指纹图谱技术对黄魁茶树品种进行鉴定，从DNA水平上给予黄魁茶独特的指纹身份，有效防止其他品种冒充黄魁茶，从而达到保护黄魁优良品种的目的。

发明内容

本发明的目的是提供一种利用SSR指纹图谱鉴别黄魁茶树品种的方法。

本发明利用SSR指纹图谱技术鉴别黄魁品种，其中涉及茶树基因组中一个特异的微卫星SSR标记，该标记的重复单元是由二碱基组成，其变异程度在茶树基因组中最高，特异SSR标记的核苷酸序列为：5′-CTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCT-3′(SEQ ID No:1)。

上述SSR标记的左、右侧翼保守序列分别如SEQ ID No:2和3所示。

基于SSR引物设计原则，根据上述SSR标记的侧翼序列设计引物，引物序列为：

上游引物：5′-AGGCTAAAGAAGATGGAG-3′，Tm：53.8℃(SEQ ID No:4)

下游引物：5′-GAGGGAATGGGTTGTCTA-3′，Tm：53.8℃(SEQ ID No:5)

SSR引物的筛选步骤如下：以四份省级茶树优良品种黄魁、黄金芽、黄金茶2号和天台黄茶作为样本材料，茶树样品总DNA的提取，根据茶树全基因组序列进行SSR位点的选择和引物的设计筛选，通过PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳初筛，然后采用Fragment Analyzer ^TM全自动毛细管电泳系统复筛，根据电泳结果筛选出核心引物。

本发明中茶树总DNA提取是采用改良的CTAB法从干茶或茶树叶片中提取基因组DNA。对茶树全基因组序列进行SSR标记的选择和引物设计筛选，在获得10万个含SSR位点的序列中，二碱基是茶树基因组中较丰富的微卫星类型，出现最多的碱基重复单元是AT、CT，从中选取2923条含有SSR位点的序列，成功设计了415对引物，其中SSR引物筛选的原则如下：

①引物的长度为18-23bp，目的片段在250bp左右。

②GC含量为45％-55％，引物序列中避免出现3或4个连续碱基。

③退火温度在45℃-55℃，最好在50℃左右，上、下游引物Tm值相差不大于4℃。

④引物3’端避免出现A或出现3个以上连续碱基，尽量避免引物二聚体和发夹结构。