[发明专利]分离小鼠内耳毛细胞的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种听力学基础实验研究替代方法，特别涉及分离小鼠内耳毛细胞的方法。

背景技术

鉴于人类内耳毛细胞的特殊解剖位置及数目甚少，应用模型动物内耳毛细胞替代是听力学研究的基础。由于成熟的毛细胞不能分裂增殖，建立及完善单个内耳毛细胞的分离方法利于更多更深入的科学实验研究。

在本发明作出之前，主要是针对豚鼠、沙鼠内耳毛细胞的分离方法研究，而小鼠的基因型研究最透彻，已成为应用最广泛的模式动物。目前对于耳蜗体积较小技术操作难度高的小鼠内耳毛细胞分离方法尚无系统描述。豚鼠、沙鼠等模式动物体积较大，操作难度相对较小，且先前的研究方法主要为用胰蛋白酶消化后机械吹打基底膜组织分离筛选毛细胞。胰蛋白酶虽为最广泛的细胞消化剂，但其化学酶作用对感觉上皮细胞(尤其是敏感脆弱的内耳毛细胞)组织损伤大，且机械吹打法定位差，须在多量细胞中筛选查找数目比例极低的毛细胞，耗时长，工作量大，同时对毛细胞机械性损伤大，获取的细胞数量少，质量低，从而影响研究的可靠性和真实性。

发明内容

本发明的目的在于克服上述事实已清楚的缺陷，详细描述分离小鼠内耳毛细胞的方法。

本发明的技术方案是：

分离小鼠内耳毛细胞的方法，其主要技术特征在于步骤如下：

(1)取出小鼠耳蜗去除表面骨质，分离取得耳蜗膜迷路；

(2)去除周边组织，分离出带柯替氏器的基底膜；

(3)胶原酶消化作用后显微分割出内毛细胞区及外毛细胞区，得到小段细胞簇；

(4)用带缓冲液的玻璃吸管分别吸取分割后的内外毛细胞簇，再吹出于载玻片上，即可获得离单的内外毛细胞。

本发明的优点和效果在于定位准确，组织损伤小，耗时短，单细胞活性质量高，筛选单细胞工作量大大减少，工作效率提高。

附图说明

图1——本发明中小鼠耳蜗示例图。

图2——本发明中剥除顶转骨壁后耳蜗示例图。

图3——本发明中耳蜗膜迷路示例图。

图4——本发明中基底膜示例图。

图5——本发明中显微分割后得一排内毛细胞示意图。

图6——本发明中离单的内外毛细胞(IHC：内毛细胞，OHC：外毛细胞)。

具体实施方式

本发明的技术思路是：

本发明结合显微切割和胶原酶消化共分离获取更多更高质量的小鼠内耳毛细胞。相较先前的分离方法克服了上述耗时长，数量质量低的诸多缺陷。本发明 的优点和效果在于：应用显微细丝行显微分割定位明确，分离细胞个体精准，不需在大量细胞中筛选查找，机械损伤小；同时胶原酶主要作用于细胞间胶原等结缔组织，消化分离组织损伤小，对作用于耳蜗基底膜消化分离单个内耳毛细胞更有针对性，更好地保持了单个细胞的活性，保证样品的纯度，更利于进行可靠的实验研究。

下面具体说明本发明。

本发明的技术步骤如下：

一、以C57BL/6小鼠为例，深度麻醉后断颈，剥离外耳道及听泡，取出带前庭底座的耳蜗；

二、去除耳蜗顶后侧骨壁后，完整剥除耳蜗外层骨壁，分离取得耳蜗膜迷路；

三、去除螺旋韧带、血管纹、盖膜等周边组织，分离出带柯替氏器的基底膜；

四、37℃预热IV型胶原酶消化作用后显微细丝分割出一排内毛细胞及三排外毛细胞，使成小段细胞簇；

五、用尖端直径约50um的玻璃吸管，先吸入一段缓冲液后，再分别吸取小段内外毛细胞簇，再吹出于载玻片上，即可获得离单的内外毛细胞。

内耳毛细胞是听力学实验研究的主要对象之一，离体的毛细胞只能培养几天不能传代。故而有效地分离内耳毛细胞技术是进行听力学相关机制实验研究的基础。豚鼠、沙鼠等耳蜗体积相对较大，毛细胞分离容易方便，但基因相关分子机制研究不透彻。小鼠是目前应用最广泛最普遍的模式动物，许多人类疾病动物模型都是依赖小鼠健全的基因序列建立的，同样越来越多的听力学研究也有赖于小鼠作为动物模型。有效分离一定数目且活性良好的内耳毛细胞是有效进行形态学观察研究及分子生物学研究的基础。

本发明旨在介绍一种结合显微切割和胶原酶消化共分离，更快获取更多更优质的小鼠内耳毛细胞的方法。

以2月龄C57BL/6小鼠为例(不分性别)，断颈后剪开耳廓皮肤，顺外耳道挑除听泡，取出耳蜗，如图1为带前庭底座的右侧小鼠耳蜗。