[发明专利]一种HPLC‑MS/MS同时测定6种水溶性维生素含量的方法

说明书

技术领域

本发明涉及维生素含量的测定方法，特别涉及一种HPLC-MS/MS同时测定6种水溶性维生素含量的方法。

背景技术

维生素是维持生命活动所必需的一种有机化合物，在生长、代谢和发育过程中发挥着重要作用。随着畜牧业的不断发展，畜禽养殖的逐渐规模化，为了满足日益增长的畜禽消费需求，畜禽的营养和健康越来越受到关注。维生素作为一种重要的维持动物机体健康的物质，在畜禽饲料中是不可或缺的。饲料中的各种维生素的量必须达到动物体的需要量，才能保证动物的健康生长和生产产品，如果缺少或不足将引起特殊的缺失综合征。目前已有13种物质或物质群被普遍认为是维生素，根据溶解度，可将其分为脂溶性维生素和水溶性维生素。水溶性维生素其结构差异大，化学性质不稳定，分离检测存在困难。水溶性维生素主要包括硫胺素（VB₁）、核黄素（VB₂）、烟酸（VB₃）、吡哆醇（VB₆）、生物素（VB₇）、钴胺素（VB₁₂）等。

现有的水溶性维生素含量的测定方法有光度法、微生物法、酶标法等，多以单一维生素测定为主，且步骤繁琐，检测周期长，操作费时；其中一些方法受干扰因素影响大，灵敏度低，无法满足对维生素快速准确检测的实际需求。随着科技的发展，仪器精密度越来越高，建立了高效液相色谱法，但高效液相色谱法可同时测定的水溶性维生素种类偏少，许多需要使用离子对试剂，易造成性质相近的维生素保留时间和洗脱顺序发生变化，影响测定结果的准确性和重现性。国标中规定的水溶性维生素的检测方法，样品前处理繁琐耗时，针对饲料中的含量低于20mg/kg水溶性维生素无法检测，并且干扰较大，试剂配制繁琐。因此，提供一种能准确、便捷、快速地测定饲料中多种维生素含量的方法，才能满足生活生产中对维生素快速准确检测的实际需求。

发明内容

本发明的目的在于克服现有使用HPLC-MS/MS测定维生素含量的测定技术中存在同时测定维生素种类少的不足，提供一种HPLC-MS/MS同时测定6种水溶性维生素含量的方法。该方法通过提高待测维生素的响应值和提高色谱仪对维生素的分离效果来达到使用HPLC-MS/MS同时测定6种维生素含量的目的，测定精度高、速度快、操作方便。

为了实现上述发明目的，本发明提供了一种HPLC-MS/MS同时测定6种水溶性维生素含量的方法，其具体步骤如下：

1、待测料和标准样品的预处理：称取适量待测料，将待测料依次经过乙酸铵溶液溶解、超声提取、冷却定容、离心、过滤得待测样品；准确称取适量的硫胺素、核黄素、烟酸、吡哆醇、生物素、钴胺素标准品配制成标准物质工作液；

2、选定HPLC-MS/MS检测条件，将步骤1得到的标准物质工作液和待测样品分别用HPLC-MS/MS进行检测，分别得到色谱图和质谱图；

3、将步骤2得到的色谱图和质谱图进行处理，对6种维生素进行定性和定量，分别得到待测样品的中6种维生素质量浓度，然后计算得到待测样品中6中维生素的含量。

上述一种HPLC-MS/MS同时测定6种水溶性维生素含量的方法，其中步骤1所述的待测料为畜禽饲料，包括仔猪料、育肥猪料、肉仔鸡料、蛋鸡料、肉鸭料等。畜禽饲料中不仅含有多种水溶性维生素，还含有蛋白质、脂肪等干扰物质，且含有的水溶性维生素含量低。

上述一种HPLC-MS/MS同时测定6种水溶性维生素含量的方法，其中步骤1所述的乙酸铵溶液浓度为0.02mol/L，pH值为4，采用乙酸作为pH调节剂。该浓度和pH下的乙酸铵溶液中溶解的6种维生素，不仅稳定性最好，不易变质，日间重现性好，而且该6种维生素的响应值同时都达到最大，有利于检测时干扰信号的排除和维生素的信号的捕捉。

上述一种HPLC-MS/MS同时测定6种水溶性维生素含量的方法，其中步骤1中超声提取的时间为15-25min，时间过长，饲料中其他较难溶解的物质也会溶解在溶剂中，对色谱和质谱的检测造成干扰，严重影响测量结果，时间过短，饲料中的维生素溶解、提取不完全，测定的含量不准确；其中，优选的，超声提取的时间为20min，即能使饲料中的维生素完全溶解在溶剂中，又能使溶剂中的杂质溶解量在一个合适的范围，对测定结果影响最小。

上述一种HPLC-MS/MS同时测定6种水溶性维生素含量的方法，其中步骤1所述的过滤采用0.22μm的水相过滤膜，能过滤溶液中大部分的杂质，减小对测定结果影响，且过滤速度较快。