[发明专利]一种通过连续克隆获得经基因修饰过的克隆猪的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种通过连续克隆技术生产经基因修饰过的克隆猪的方法，属于繁殖生物学领域。

背景技术

近年来，基因修饰猪作为人类疾病模型的深入研究构建尚未全面，且存在构建效率低、应用范围狭窄的不足，从动物基因修饰的克隆猪角度建立的动物疾病模型有利于深入地探索人类相关疾病的发病机制、致病机理以及诊疗途径，对人类疾病的临床模型的构建及临床转化应用具有重要的参考价值，尤其通过连续克隆方法获得的经基因修饰的克隆猪作为动物疾病模型的研究更具有来源的可重复性、研究的可靠性以及遗传的稳定性，猪体内的病理环境、生理状况、生化机制以及在疾病的发生发展过程机制方面都与人类十分接近，利用该方法建立的基因修饰克隆猪模型为人类相关疾病的研究提供了重要的模型参考。

目前，猪的基因打靶技术虽能改变动物特定基因表达模式，但是操作极为困难，猪的转基因技术虽然操作简单，周期短，但是获得经目的基因修饰过的猪个体效率低，且个体间差异大，很难达到预期的效果。

因此，需对现有的技术进行改进，设计出一种效率高、重复性好、实用性强、能高效批量生产目的基因表达和表型稳定的基因修饰猪个体的方法。

发明内容

针对以上技术问题，本发明提供了一种通过连续克隆获得经基因修饰过的克隆猪的方法，本方法通过连续克隆技术对经目的基因修饰过的猪进行连续克隆，成功批量地获得了经目的基因修饰过的克隆猪，该方法技术可靠，效率高、重复性好、实用性强、能高效批量生产目的基因表达和表型稳定的基因修饰猪个体，便于建立可靠的动物疾病模型及科学地验证相关基因的功能。

为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种通过连续克隆获得经基因修饰过的克隆猪的方法，按照以下步骤进行：

第一步、基因修饰猪成纤维供体细胞的培养与细胞系的建立

获取刚出生的基因修饰猪的组织，建立基因修饰猪成纤维细胞系并进行传代培养；

第二步、卵母细胞的准备

从屠宰场收集的母猪卵巢，保存在适温生理盐水中运送回实验室，挑取猪的卵母细胞并进行体外成熟培养；

第三步、重构胚的构建

卵母细胞经过体外成熟培养后，用0.1mg.mL^-1的透明质酸钠去除卵母细胞外围的卵丘细胞，将排出第一极体的卵母细胞放入预处理液中处理0.5～1h后移入卵母细胞操作液中，用显微注射针将极体及其周围胞质一起去除，然后将经基因修饰的猪成纤维供体体细胞导入去核的卵母细胞的卵间隙中，移出注射针，并轻轻按压供体细胞上方的透明带，使供体细胞与卵母细胞膜紧贴，获得重构胚；

第四步、重构胚的电融合、电激活及体外培养

1)重构胚的电融合和电激活；

2)重构胚的体外培养；

第五步、胚胎移植及基因修饰克隆猪的获取

选取自然发情的母猪作为胚胎移植的代孕母猪，将重构胚用胚胎移植管移植到即将排卵或已排卵的两侧输卵管膨大部位后进行发育，妊娠114d后代孕母猪分娩获得基因修饰的克隆猪。

进一步，作为优选，在第一步基因修饰猪成纤维供体细胞的培养与细胞系的建立中，进行细胞传代培养前细胞消化离心转速为1000rpm，时间为5min。

进一步，作为优选，第三步中预处理液为NCSU23中含0.1μg.mL^-1秋水仙胺、0.05mol.L^-1蔗糖和4mg.mL^-1BSA。操作液为10μmol.L^-1Hepes和0.3％聚乙烯吡咯烷酮含有0.1μg.mL^-1秋水酰胺、5μg.mL^-1细胞松弛素。

进一步，作为优选，第四步1)中，重构胚的电融合参数为：25V/mm×20μs×1次，电激活参数为：150V/mm×100μs×1次，电融合液的组成为：0.25mol/LD-山梨醇、0.05mmol/LMg(C₂H₃O₂)₂、20mg/mlBSA、0.5mmol/LHEPES，电激活液的组成为：0.25mol/LD-山梨醇、0.01mmol/LCa(C₂H₃O₂)₂、0.05mmol/LMg(C₂H₃O₂)_2、0.1mg/mlBSA。

本发明的有益效果：