[发明专利]表达类禽型H1N1猪流感病毒HA蛋白的重组复制缺陷型腺病毒及其构建方法和用途

权利要求书

1.表达类禽型H1N1猪流感病毒HA蛋白的重组复制缺陷型腺病毒，其特征在于所述重组复制缺陷型腺病毒是以E1、E3联合缺失的复制缺陷型人5型腺病毒骨架质粒为载体，通过同源重组在所述的E1、E3联合缺失的复制缺陷型人5型腺病毒骨架质粒的E1区插入类禽型H1N1猪流感病毒HA囊膜糖蛋白的编码基因，以整合腺病毒E1基因的HEK293细胞为包装细胞系获得的。

2.如权利要求1所述的重组复制缺陷型腺病毒，其特征在于在所述的E1、E3联合缺失的复制缺陷型人5型腺病毒骨架质粒的E1区插入类禽型H1N1猪流感病毒HA囊膜糖蛋白编码基因的同时，还包括在E1区进一步插入用于筛选重组复制缺陷型腺病毒的绿色荧光蛋白示踪基因EGFP。

3.如权利要求2所述的重组复制缺陷型腺病毒，其特征在于所述的类禽型H1N1猪流感病毒HA蛋白的编码基因为SEQIDNO.1所示的序列，或是与其具有遗传密码简并性，且编码相同蛋白质的序列。

4.一种构建权利要求2所述的重组复制缺陷型腺病毒的方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)获得编码类禽型H1N1猪流感病毒HA蛋白的基因序列

通过基因合成或PCR扩增获得编码类禽型H1N1猪流感病毒HA蛋白的基因片段，所获得的编码类禽型H1N1猪流感病毒HA蛋白的基因片段的两端含有用于实现与腺病毒穿梭质粒pDC315-EGFP同源重组的同源序列以及EcoRI和NheI限制性内切酶酶切位点；

(2)重组腺病毒穿梭质粒pDC315-EGFP的构建

第一步：以pIRES2-EGFP为模板用P1和P2引物对IRES-EGFP序列扩增，得到IRES-EGFP片段，同时利用限制性内切酶BamHI以及SalI对腺病毒穿梭质粒pDC315进行双酶切，然后进行琼脂糖凝胶电泳，胶回收大片段；将得到的IRES-EGFP片段与pDC315酶切产物大片段进行连接，经过双酶切鉴定以及测序鉴定，将所获得的重组穿梭质粒命名为pDC315-EGFP；

P1:5’-AATTCAAGCTGCTAGCAAGGATCCGCCCCTCTCCCTCCC-3’；

P2:5’-ATAAACAAGTTGCTCGAAGTCGACTTACTTGTACAGCTCGTCCATG-3’；

第二步：将pDC315-EGFP穿梭质粒通过EcoRI以及NheI限制性内切酶进行双酶切，胶回收大片段后，与步骤(1)得到的编码类禽型H1N1猪流感病毒HA蛋白的基因片段通过同源序列进行连接，测序鉴定，获得重组腺病毒穿梭质粒，并命名为pDC315-HA-EGFP；

(3)重组复制缺陷型腺病毒的包装

将步骤(2)构建的重组腺病毒穿梭质粒pDC315-HA-EGFP与E1、E3联合缺失的复制缺陷型人5型腺病毒骨架质粒pBHGlox△E1,E3Cre共转染整合腺病毒E1基因的HEK293细胞，重组腺病毒穿梭质粒pDC315-HA-EGFP与E1、E3联合缺失的复制缺陷型人5型腺病毒骨架质粒pBHGlox△E1,E3Cre发生同源重组，HA基因及示踪基因EGFP整合到复制缺陷型人5型腺病毒骨架质粒的E1区，并在HEK293细胞反式补偿E1区功能下增殖并包装产生成熟腺病毒粒子；

(4)收获重组复制缺陷型腺病毒

当转染的细胞出现特征病变，反复冻融细胞，获得表达类禽型H1N1猪流感病毒HA蛋白以及绿色荧光蛋白EGFP的重组复制缺陷型腺病毒。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于所述的编码类禽型H1N1猪流感病毒HA蛋白的基因片段的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。

6.权利要求1-3任一项所述的表达类禽型H1N1猪流感病毒HA蛋白的重组复制缺陷型腺病毒在制备类禽型H1N1猪流感疫苗中的用途。

7.一种用于预防类禽型H1N1猪流感的重组复制缺陷型腺病毒载体疫苗，其特征在于含有权利要求1-3任一项所述的表达类禽型H1N1猪流感病毒HA蛋白的重组复制缺陷型腺病毒。